结核分枝杆菌检测方法的初探及其与宿主互作蛋白的筛选
发布时间：2020-08-18 10:10
【摘要】：结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAPMPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein 1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein 1的互作。2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：
图 1-1 2016 年结核病发病率(标注为至少十万以上病例的国家) (WHO, 2017)Fig.1-1 Estimated TB incidence in 2016 (for countries with at least 100 000 incident cases)(WHO, 2017)1.1.2 结核分枝杆菌病原特性结核分枝杆菌呈细长略弯曲状，聚集呈分枝状排列增殖。因其细胞壁含有大量脂质，用革兰氏染色法不易着色，经萋-尼式抗酸染色呈红色，无菌毛和鞭毛，有荚膜，单在、成双、间或成丛排列，结核分枝杆菌对培养基的要求很高，通常所用的培养基为罗氏培养基或者 7H9 培养基，生长极其缓慢且在生长的过程中容易聚集成团，在培养基中加适量的吐温能够减少菌体成团（Mcnerney R, et al., 2011）。在电镜下观察 Mtb 有复杂结构：其由微荚膜，细胞外壳的三层结构（胞浆膜、胞浆、间体），核糖体及中间核质构成。结核分枝杆菌对酸、碱和干燥的环境有很强的抵抗能力，对湿热的环境很敏感，酒精和紫外线都可以将结核分枝杆菌杀灭（吴雪琼，2006）。
结核分枝杆菌的检测及其分泌蛋白与宿主互作的研究2009）；另一方面，有研究表明肉芽肿实际上是一种有效的扩大细菌感染的工具（BoldT D, et al., 2009）。大多数感染 Mtb 的人可以保持没有临床症状的潜伏感染状态，只有 5%-10%的感染 Mtb 的人会发展为活动性结核病病人。而大部分潜伏感染的病人体内的 Mtb 处于休眠状态，一旦机体的免疫机能下降，就会导致 Mtb 从感染病灶中释放出来，扩散进入呼吸道，意味着肺结核的复发。在整个过程中，Mtb 与巨噬细胞之间的相互作用对机体感染后的走势是很重要的（Mcnicholl J M, et al., 2000）。
结核分枝杆菌的检测及其分泌蛋白与宿主互作的研究短，而且假阳性的结果也较少。传统的标签组binding peptide, CBP）和蛋白 A 的 IgG 结合域（acco etch virus, TEV）蛋白剪切位点连接（Rigaut中内源性钙调蛋白会影响融合蛋白的结合，使亲和层析的方法不断地开发更新，已经有几十，新的标签在不同程度不同方面提高蛋白纯化roteinC, 3×Flag-His, 2×StrepⅡ-Flag, SBP-His 和 Zet al., 2013）。程主要有：构建 TAP 所用标签与目的蛋白融合细胞中得到稳定表达目的蛋白的细胞系，获得纯化得到蛋白复合物并进行质谱分析（Tang Z
本文编号：2796091
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：
图 1-1 2016 年结核病发病率(标注为至少十万以上病例的国家) (WHO, 2017)Fig.1-1 Estimated TB incidence in 2016 (for countries with at least 100 000 incident cases)(WHO, 2017)1.1.2 结核分枝杆菌病原特性结核分枝杆菌呈细长略弯曲状，聚集呈分枝状排列增殖。因其细胞壁含有大量脂质，用革兰氏染色法不易着色，经萋-尼式抗酸染色呈红色，无菌毛和鞭毛，有荚膜，单在、成双、间或成丛排列，结核分枝杆菌对培养基的要求很高，通常所用的培养基为罗氏培养基或者 7H9 培养基，生长极其缓慢且在生长的过程中容易聚集成团，在培养基中加适量的吐温能够减少菌体成团（Mcnerney R, et al., 2011）。在电镜下观察 Mtb 有复杂结构：其由微荚膜，细胞外壳的三层结构（胞浆膜、胞浆、间体），核糖体及中间核质构成。结核分枝杆菌对酸、碱和干燥的环境有很强的抵抗能力，对湿热的环境很敏感，酒精和紫外线都可以将结核分枝杆菌杀灭（吴雪琼，2006）。
结核分枝杆菌的检测及其分泌蛋白与宿主互作的研究2009）；另一方面，有研究表明肉芽肿实际上是一种有效的扩大细菌感染的工具（BoldT D, et al., 2009）。大多数感染 Mtb 的人可以保持没有临床症状的潜伏感染状态，只有 5%-10%的感染 Mtb 的人会发展为活动性结核病病人。而大部分潜伏感染的病人体内的 Mtb 处于休眠状态，一旦机体的免疫机能下降，就会导致 Mtb 从感染病灶中释放出来，扩散进入呼吸道，意味着肺结核的复发。在整个过程中，Mtb 与巨噬细胞之间的相互作用对机体感染后的走势是很重要的（Mcnicholl J M, et al., 2000）。
结核分枝杆菌的检测及其分泌蛋白与宿主互作的研究短，而且假阳性的结果也较少。传统的标签组binding peptide, CBP）和蛋白 A 的 IgG 结合域（acco etch virus, TEV）蛋白剪切位点连接（Rigaut中内源性钙调蛋白会影响融合蛋白的结合，使亲和层析的方法不断地开发更新，已经有几十，新的标签在不同程度不同方面提高蛋白纯化roteinC, 3×Flag-His, 2×StrepⅡ-Flag, SBP-His 和 Zet al., 2013）。程主要有：构建 TAP 所用标签与目的蛋白融合细胞中得到稳定表达目的蛋白的细胞系，获得纯化得到蛋白复合物并进行质谱分析（Tang Z
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1 伍享;结核分枝杆菌检测方法的初探及其与宿主互作蛋白的筛选[D];华中农业大学;2018年
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