冷冻前后牦牛精子质量与HSP家族基因表达的相关性研究

发布时间：2020-08-21 09:51

【摘要】：人工授精(Artificial insemination,AI)技术是提高家畜繁殖效率的重要环节,因此筛选获得高质量的冻精非常重要。然而,冻融过程导致精子品质降低,繁殖力下降,影响了良种公牛种用价值,而且增加养殖成本。以往研究表明,细胞及生物体可通过合成热应激蛋白HSPs来保护细胞免受外界伤害,且HSPs的表达水平与公畜的受精率密切相关。目前,尚无关于牦牛HSP70和HSP90与精子品质相关性的报道。本研究以牦牛鲜精和冻融精子为试验材料,经45%Percoll单层梯度液纯化后,通过检测和分析牦牛精子质量和精子内酶活性差异,采用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术检测HSP70和HSP90表达情况,并分析牦牛HSP70和HSP90表达量与精子质量的相关性,为牦牛精子质量和繁殖力的高低进行标记辅助评价提供科学依据。主要研究结果如下:1.试剂盒(RNeasy Kit)、热TRIzol和TRIzol一步法都可以获得牦牛精子总RNA,但试剂盒提取的精子总RNA质量(浓度、纯度、完整性)优于另外两种方法(P0.05)。2.通过比较鲜精和冻精的精子活力、畸形率、顶体完整率和质膜完整率发现,与鲜精相比,冻融后精子活力降低50.54%(P0.01),精子畸形率提高56.60%(P0.01),精子顶体完整率降低32.33%(P0.01),精子质膜完整率降低51.28%(P0.01)。扫描电镜结果显示,鲜精的质膜和顶体光滑且完整,而部分冻融精子质膜和顶体受损。酶活性检测结果发现,冻融后精子内GSH-PX、SOD、AST、ACP和LDH酶活极显著低于鲜精(P0.01),与鲜精相比,分别降低67.65%、67.38%、61.58%、49.53%和47.06%。3.牦牛鲜精与冻精HSP70和HSP90表达差异比较研究中发现,冻融精子HSP70和HSP90在转录和蛋白水平表达量均显著低于鲜精(P0.05)。鲜精HSP70蛋白主要在精子顶体区、顶体赤道段、后顶体区、精子中段以及精子尾部表达,而冻精HSP70蛋白主要在精子后顶体区和精子中段表达且平均光密度值极显著降低(P0.01)。鲜精和冻精中HSP90蛋白表达均在精子中段和尾部表达,冻融精子中段HSP90的荧光信号强度极显著低于鲜精(P0.01),暗示蛋白定位与精子品质有关。相关性分析可知,HSP70表达量与精子活力(r=0.753,P0.01)、质膜完整率(r=0.656,P0.05)以及顶体完整率(r=0.632,P0.05)之间均存在显著正相关。精子HSP90表达量与精子活力(r=0.723,P0.01)、质膜完整率(r=0.586,P0.05)之间存在显著正相关,而HSP90表达量与顶体完整率(r=0.370,P0.05)之间存在正相关。综上表明,冻融导致精子品质、HSP70、HSP90表达量显著降低,且HSP70、HSP90 mRNA表达量与精子品质存在正相关,可作为评价牦牛精子品质的指标。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826
【图文】：

19图 1 精子纯化结果Fig.1 The results of Sperm purification.：a，纯化前结果；b，纯化后结果。ote: a, Pre-purification results; b, Post- purification results.牛精子总 RNA 提取方法的比较本试验前期对哺乳动物精子总RNA的提取方法进行总结，发现试剂盒（RNeasRIzol 和 TRIzol 一步法是近年来常用的 3 种精子总 RNA 提取方法。因此本研究上述 3 种方法提取牦牛冷冻精子总 RNA，并分别检测其浓度和纯度以及CR 检测总 RNA 质量，最终从中筛选适合牦牛精子总 RNA 提取的方法。精子总 RNA 浓度和纯度检测由表 3 可知，试剂盒提取牦牛冷冻精子总 RNA 的 OD260/280为 1.89 ±0.15 显著

图 2 GAPDH 和 β-actin 基因扩增电泳图Fig.2 Agarose gel electropherogram after amplification of the GAPDH and β-actin genes.注：G1～G3，GAPDH 基因扩增产物；A1～A3，β-actin 基因扩增产物.Ⅰ，试剂盒法；Ⅱ，热 TRIzol 法；Ⅲ，TRIzol 一步法。下同Note: G1～G3, PCR product of GAPDH; A1～A3, PCR product of β-actin.Ⅰ, The kit; Ⅱ, Hot-TRIzol; Ⅲ, One-step TRIzol. The same as follows.3 种方法提取的牦牛冷冻精子总 RNA 样品针对成熟精子细胞内表达的基因 SRY、RPS23 通过 RT-PCR 检测发现，试剂盒提取的 RNA 扩增出 SRY（150 bp）、RPS23（19bp）基因条带；热 TRIzol 和 TRIzol 一步法均只出现 SRY 基因条带（见图 3）。说明试剂盒提取精子总 RNA 的质量优于另外两种方法。

图 2 GAPDH 和 β-actin 基因扩增电泳图Fig.2 Agarose gel electropherogram after amplification of the GAPDH and β-actin genes.注：G1～G3，GAPDH 基因扩增产物；A1～A3，β-actin 基因扩增产物.Ⅰ，试剂盒法；Ⅱ，热 TRIzol 法；Ⅲ，TRIzol 一步法。下同Note: G1～G3, PCR product of GAPDH; A1～A3, PCR product of β-actin.Ⅰ, The kit; Ⅱ, Hot-TRIzol; Ⅲ, One-step TRIzol. The same as follows.3 种方法提取的牦牛冷冻精子总 RNA 样品针对成熟精子细胞内表达的基因 SRY、RPS23 通过 RT-PCR 检测发现，试剂盒提取的 RNA 扩增出 SRY（150 bp）、RPS23（19bp）基因条带；热 TRIzol 和 TRIzol 一步法均只出现 SRY 基因条带（见图 3）。说明试剂盒提取精子总 RNA 的质量优于另外两种方法。

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本文编号：2799228