单增李斯特菌Lmo0331蛋白基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究

发布时间：2020-08-22 21:49

【摘要】：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的人兽共患食源性病原菌,对人和多种动物的健康威胁较大。LM能在多种毒力因子作用下,穿越宿主的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障,从而引起败血症、脑膜炎、流产等疾病,死亡率高达30%。LPXTG基序表面蛋白在LM感染细胞过程中发挥重要作用。Lmo0331蛋白是根据LM全基因组序列推测的LPXTG基序表面蛋白,但是其功能尚不清楚。本研究以绵羊李斯特菌病的脑组织分离株LM90SB2(血清型4b)为研究对象,首先对LM90SB2的lmo0331基因进行序列分析及原核表达;利用同源重组技术构建LM90SB2的lmo0331基因缺失株,与亲本株比较,对不同细胞粘附侵袭能力、小鼠的致病性、环境适应性等生物学特性,初步探究lmo0331基因的功能。为进一步研究LM的致病机制奠定基础。1.LM90SB2 lmo0331基因分析和原核表达为了对单增李斯特菌临床分离株LM90SB2的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、蛋白质结构域分析和原核表达。根据GenBank中收录的lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核酸序列与NTSN株(4b型,绵羊脑,中国江苏)、F2365株(4b型,奶酪,美国)、LL195株(4b型,瑞士)及WSLC 1033株的同源性为100.0%,与N2306株(4b,李斯特菌病人的血液,瑞士)、02-1792株(4b,加拿大,奶酪)、H34株的同源性为99.9%。分离株LM90SB2的lmo0331基因全长1956bp,ORF全长为1857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,Lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。2.LM90SB2△lmo0331缺失株的构建为了构建LM90SB2△lmo0331缺失株,PCR扩增LM90SB2 lmo0331基因的上下游臂,通过重叠PCR技术将lmo0331基因的上下游臂融合扩增得到△lmo0331基因片段,将△lmo0331基因片段与自杀性质粒pKSV7连接。将重组质粒pKSV7-△lmo0331电转化到LM90SB2感受态中,PCR筛选阳性转化子。获得的阳性转化子置于含氯霉素的BHI培养基中41℃传代培养,在双重压力下实现同源重组,旁侧引物检测重组情况。重组完全的菌株置于30℃无抗性培养基中连续传代,丢失pKSV7穿梭质粒,并检测其稳定性。通过PCR和测序结果显示表明lmo0331基因编码区被完全删除,且缺失株具有良好的遗传稳定性。3.lmo0331基因缺失对LM90SB2体外环境耐受性影响为了探究lmo0331基因对LM环境适应性的影响,比较了LM90SB2△lmo0331和LM90SB2在不同温度、pH、渗透压下生长特性、生物被膜形成能力等差异。结果显示:在4℃环境下,LM90SB△lmo0331缺失株的生长速度显著高于LM90SB2野毒株(P0.05);体外耐酸耐碱试验中,在碱性环境中(pH=9)LM90SB2△lmo0331缺失株生长能力低于亲本株LM90SB2(P0.05);在含4.5%乙醇的BHI培养基中,LM90SB2△lmo0331生长趋势显著低于LM90SB2(P0.05),在含0.5%NaCl的BHI培养基中LM90SB2△lmo0331生长趋势显著高于LM90SB2(P0.05)。提示Lmo0331蛋白对细菌的耐碱有重要作用。4.lmo0331基因缺失对LM90SB2毒力的影响为了探究lmo0331基因对LM毒力的影响,比较了LM90SB2△lmo0331与LM90SB2对不同细胞系的粘附侵袭能力和对小鼠毒力以及在小鼠肝脏、脾脏和脑中定植能力的差异。结果显示:LM90SB2△lmo0331缺失株对多种细胞系的粘附侵袭能力有所下降。LM90SB2△lmo0331对RAW264.7、MBMEC、SIEC、HBMEC的粘附能力显著下降(P0.05);LM90SB2△lmo0331对RAW264.7、MBMEC的侵袭能力显著下降(P0.05)。小鼠感染试验显示lmo0331基因缺失后LM90SB2的毒力下降,LM90△lmo0331与LM90SB2相比LD_(50)提高了0.97个数量级。在小鼠感染后不同时间点,LM90SB2△lmo0331在肝脏和脑内的载菌量均显著低于LM90SB2,在脾脏中只有在48 h时显著低于野毒株的载菌量。提示表面蛋白Lmo0331参与LM90SB2对小鼠的毒力。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

重组质粒,条带,双酶,蛋白基因

单增李斯特菌 Lmo0331 蛋白基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究果0331 基因 PCR 扩增及克隆用特异特异性引物以 LM90SB2 的 DNA 为模板 PCR 扩增出 lmo0检测，所扩增的目的 PCR 产物大小约 1956 bp 左右（图 1-1）。克隆性菌液，提取重组质粒 pMD19T-0331，经 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶在约 1956 bp 出现目的条带，在 2.6 kbp 出现一条长的载体条带，与-2）。M 1 2 3 4M 1 2

PCR扩增,基因,条带

菌株,比对分析,同源性,氨基酸序列

NTSN、F2365、WSLC 1003、LL195的相似性为100%，与N2306、02-1792、H34、SLCC2755相似性均为99%以上，与M7、08-5578的相似性分别为90.6%、90.7%，与标准株EGDe的相似性为88.7%（图1-4）。同源性 Percent Identity (%)变异度Divergence(%)图 1-4 不同菌株 lmo0331 氨基酸序列与参考菌株同源性比对分析Fig.1-4 Homology analysis of amino sequences of lm0331 in various strains图 1-3 不同菌株 lmo0331 基因核苷酸序列与参考菌株同源性比对分析Fig.1-3 Homology analysis of nucleotide sequences of lm0331 gene in various strains同源性 Percent Identity (%)变异度Divergence(%)

【参考文献】