猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗生产工艺研究

发布时间：2020-08-24 10:43

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。2010年2月和2011年3月,O型缅甸98(Mya98)系和“新一轮”泛亚(PanAsia-1)系传入我国后迅速扩散,对我国养殖业和农村经济发展造成了巨大影响。我国防控FMD采取免疫与扑杀相结合的综合措施,免费对所用家畜进行灭活疫苗强制免疫,但因FMDV本身免疫原性弱,免疫持续期短,存在生物安全隐患,不利于FMD的净化等因素的限制,使得FMD防控工作很难开展。因此,更多的学者将目光投入了FMD基因工程疫苗的研究。本研究是将实验室构建的猪O型FMD基因工程菌进行工业化放大的生产工艺研究,通过检验对各个工艺流程进行效果评价,建立一套成熟、稳定的猪FMD O型复合表位蛋白疫苗的生产工艺流程。将保存菌种进行形态、酶切、目的蛋白表达及Western blot鉴定。分别从诱导条件、培养基、接种量、pH、补料方式等因素进行优化,使单位体积内培养液获得最大菌体数量。采用浊度法测量发酵液的光密度,计算菌体重量,来分析各个优化参数的效果。结果显示:发酵培养最适培养时间为8h,诱导时间为8h,诱导温度为37℃;培养基中最适磷酸盐浓度为100mmol/L,微量元素溶液为1mL/L;最适接种量为5%,pH为7.0~7.2,装液量30%;采用变指数-恒pH混合流加补料,补料液为氨水、甘油,其中甘油较葡萄糖更利于目的产物的获得。采用中空纤维系统对菌体进行收集,高压均质机不同压力对菌体进行破碎,对比破碎效果,将收集的包涵体通过裂解进行了亲和层析纯化,用不同浓度的咪唑进行洗脱,确定最佳的咪唑洗脱浓度为100 mM。分别选取不同温度、不同稀释速度对收集的纯化蛋白进行复性,通过检验复性后蛋白质的活性、浓度,确定最佳复性条件。最后进行过滤除菌分装。将获得的抗原样品进行无菌检验,通过BCA法检验蛋白浓度约为1 mg/mL,通过凝胶法检验蛋白内毒素含量小于50 EU/mL,利用间接血凝法检验蛋白活性为1:1024,表达产物经SDS-PAGE分析蛋白分子量为25.5ku,采用Image Lab软件分析蛋白纯度90%以上,Western Blot方法检测结果显示,转移至硝酸纤维素膜上与牛FMDV阳性血清反应,具有良好的反应性。参照现有口蹄疫灭活疫苗乳化工艺,选用ISA 206和ISA 201 VG油佐剂,分别用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例进行乳化,制备疫苗。于2~8℃保存15个月,分别于第3、6、9、12、15个月取样,进行疫苗物理性状检验,并进行效力对比。结果显示:疫苗水相和油相最佳配制比例为1:1。疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度均符合产品的质量要求,两种油佐剂制备的乳剂均能诱导免疫猪产生1:64以上的抗体,ISA 201 VG佐剂疫苗免疫猪产生抗体水平高于ISA 206油佐剂,ISA 201 VG佐剂各免疫剂量组均获得全保护。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.53
【图文】：

切向流,中空纤维

甘肃农业大学 2018 博士学位论文第一章口蹄疫基因工程疫苗研究进展广。随着工艺技术的要求，切向流过滤 (TFF) 系统目前正在进入生产工艺。对于会快速堵塞死端过滤仪器的分离液体来说，切向流过滤是一种有效的解决方法。使用切向流过滤时，大多数处理液会顺着膜表面流动，而不是通过膜结构。液体会以与膜表面平行的相对较高的速度被泵送出。除了水处理应用外，顺着膜表面的切向流只有一小部分会被渗透。比如，在多数细胞和颗粒分离中，只有 1%~5% 进样到膜设备的流量会成为渗透液，剩下的 95%~99% 会退出膜设备成为“保留”。保留液会再循环至处理容器和组件入口，其中的 1%~5%会再作为渗透液被移除。再循环处理以快速连续的方式进行，产生一个显著、持续的渗透率 (见图 1-1)。

猪口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗生产工艺研究

传统过滤

形态图,菌落形态,菌种,形态

结果.1 BL21-FMDV-B4 的鉴定.1.1 BL21-FMDV-B4 形态鉴定菌种 BL21-FMDV-B4 检验结果，菌落形态（图 2-2A）、革兰氏染色细菌态（图 2-2B）均符合规定。图 2-1 菌体干重与细菌密度关系的标准曲线Fig. 2-1 The standard curve of the relationship between the dryweight of the mycelium and the density of bacteria

【参考文献】