LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的分子机制研究

发布时间：2020-08-27 13:10

【摘要】：奶牛乳腺炎是制约奶业发展的重要多发性疾病之一,给奶业带来巨大损失并危及人类健康。奶牛乳腺炎的主要病因是病原菌的侵入,其中大肠杆菌(Escherichia coli)是乳腺炎最常见的环境病原菌之一。大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌,细胞外膜中存在内毒素——脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。在奶牛乳腺炎发生过程中,LPS会通过发病乳腺组织进入到血液中引发全身性炎症以及脓毒血症。奶牛乳腺上皮细胞作为构成乳腺先天免疫屏障的重要组成部分,在抵抗病原菌入侵方面起关键作用,乳腺上皮细胞凋亡对乳腺炎的免疫防御具有重要意义。研究LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的分子机制,为奶牛乳腺炎的防治提供依据。本研究首先利用酶消化法体外分离得到奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)并纯化鉴定。其次,以此细胞为细胞模型,检测LPS处理对细胞增殖、炎性因子分泌、凋亡的影响,结果显示:(1)LPS抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖;(2)LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞分泌炎性相关因子TNF-α、IL-18,且具有一定的时间依赖性(p0.01);(3)LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡,并且随LPS处理浓度和时间的增加,细胞凋亡率也有升高趋势。这预示着LPS可能通过炎性因子的表达诱导细胞凋亡,进而抑制细胞增殖。再次,通过分子细胞生物学手段研究LPS诱导细胞发生凋亡的途径。结果发现:(1)LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞使TLR-4、MyD88和FADD表达增加,而Caspase-8前体蛋白表达量减少;(2)沉默MyD88基因,LPS刺激细胞炎性因子TNF-α的分泌量显著降低(p0.01),而沉默TIRAP基因,TNF-α的分泌量无显著变化(p0.05)。以上结果初步表明,LPS被膜受体TLR-4识别后,通过MyD88依赖型信号通路以及胞外死亡受体途径诱导细胞凋亡。最后,通过使用Rapamycin预处理细胞,探讨mTORC1信号通路对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的调控作用。结果发现:(1)LPS激活奶牛乳腺上皮细胞mTORC1信号通路,Rapamycin减弱LPS诱导的mTORC1信号通路活性;(2)Rapamycin抑制LPS诱导的pro-Caspase-3蛋白的裂解;(3)Rapamycin减少LPS诱导的MyD88、FADD蛋白表达;(4)Rapamycin降低LPS诱导的转录因子STAT1的磷酸化水平。根据以上结果可以推测mTOR信号通路可能通过调控转录因子STAT1来调节LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。总之,LPS可以诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡。LPS被细胞膜受体TLR4识别,募集衔接蛋白MyD88,构成LPS/TLR-4/MyD88信号通路,激活转录因子STAT1,分泌炎性因子TNF-α和IL-18;LPS刺激后FADD表达水平升高,pro-Caspase-8的表达量下降,预示着LPS可能是通过经典的死亡受体通路诱导细胞发生凋亡。mTORC1信号通路调控MyD88、FADD、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达,这一过程可能是通过对转录因子STAT1活性的调节来实现的。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【图文】：

细胞,胶原酶,透明质酸酶,消化酶

主要是利用消化酶（胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶或几种酶相组织，利用含血清的培养基终止消化后经滤网过滤、离心收集得究表明，利用胶原酶消化得到了体外可培养 30~40 代的奶牛乳腺细胞数量较多，培养周期较组织块贴壁法短，但实验操作过程中化时间，否则对细胞的损伤较大[25]。图 1.2 为通过胶原酶消化法胞。图 1.1 组织块贴壁法法分离得到的细胞A：成纤维细胞；B：奶牛乳腺上皮细胞Fig. 1.1 The cells were isolated by tissue-block adhesion methodA: fibroblasts; B: bovine mammary epithelial cells

乳汁,分离法,腺上皮细胞,乳腺上皮细胞

是直接从新鲜的乳汁中通过反复离心获得的乳腺上皮细胞团是由于泌乳期，会有一些乳腺上皮细胞脱落进入乳汁当中。噬细胞，吞噬自身以外的杂质来降低培养过程中的污染，无失[23]。利用乳汁分离法培养上皮细胞，在培养的 4~6 天可见屿状的克隆团。所以此法操作简便、成本低、细胞纯度较高奶的质量及数量都有较高的要求外所分离得到的细胞数量也分离得到的奶牛乳腺上皮细胞。隆(100×);B:多角形细胞(100×):C:鹅卵石状细胞,红色标记为成纤维细胞与鹅卵石样混合生长的细胞ig. 1.2 Bovine mammary epithelial cells isoltaed by collagenase digestionhe cell clone generated from a single cell (100x): B: T The polygonous celg stone cells, fibroblasts were noted by red color(100%); D: The cells withpaving stone and polygonous grew together (100)

途径,细胞凋亡,天然杀伤细胞

途径淋巴细胞（如细胞毒性 T 细胞、与天然杀伤细胞），可通过多种机细胞能向靶细胞传递一些毒性颗粒，释放的颗粒中包含了大量颗图 1.4 细胞凋亡的胞外和胞内途径[42]途径中 Fas 或 TRAIL 等被相应配体激活，这些信号通过死亡受体蛋白 Fse-8。胞内线粒体途径主要是由细胞外的刺激等不同的信号启动，Bcl-2 家是胞内途径的重要组成部分，并含有一系列的凋亡因子。Fig.1.4 Extrinsic and intrinsic pathways of apoptosispoptosis is controlled bynumerous interrelating processes. The extrinsic pathwignals suchas Fas ligand (FasL) or TRAIL, which act through death receptors.activated through Fas-associated death domain (FADD). The intrinsic pathwaynals, primarily extracellular stimuli. Mitochondria are an essentialcomponent o harbor an array of apoptotic factors. The Bcl-2family is a primary regulator opathway.

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