牛支原体表达载体的构建

发布时间：2020-08-28 04:17

【摘要】：牛支原体是导致牛的多种疾病综合症的病原体之一,并给养牛业带来了严重的经济损失。但是,由于缺乏有效的基因操作工具,关于牛支原体的致病机理的研究相对较少。作为功能性的DNA复制起始元件,oriC基因序列已经在多种支原体中得到应用,但是尚无在牛支原体中应用的报道。本研究利用牛支原体的oriC序列构建了可以转染牛支原体的载体系统。通过截短试验,找到牛支原体oriC最小的功能域,该区域富含A+T,并且包含两个dnaAbox。通过稳定性实验检测,本研究构建的oriC载体转化株经过30次传代,载体仍然能够以质粒的形式稳定存在,而没有整合到牛支原体的基因组中。即使在无抗性筛选的条件下,转化株经30次传代仍然能够携带质粒。另外,该载体系统能够在牛支原体中成功表达由LacZ报告基因编码的外源蛋白p-半乳糖苷酶,以及同FLAG标签蛋白融合表达的内源蛋白。同时,利用Western blot验证了该oriC自我复制载体具有作为过表达载体使用的潜能。牛支原体没有细胞壁,因此细胞膜对于其生长、繁殖以及黏附宿主细胞起着至关重要的作用。为了探究牛支原体膜蛋白以及膜相关蛋白的基因功能,利用该载体系统,分别构建了MBOVPG45_0790蛋白和P48蛋白过表达牛支原体菌株,通过间接免疫荧光方法与流式细胞术分别比较了牛支原体PG45标准株、MBOVPG45_0790蛋白过表达株和P48蛋白过表达株对牛肾细胞的黏附与诱导凋亡的作用。MBOVPG45_0790蛋白过表达株和P48蛋白过表达株对牛肾细胞的黏附以及诱导凋亡的程度与对照组无明显差异,显示了这两种蛋白的单一过表达不会对牛支原体黏附及诱导牛肾细胞凋亡产生影响。综上,本研究利用复制起始元件oriC、启动子元件prvVSPA以及抗性基因元件tetM成功的构建了应用于牛支原体的自我复制载体系统,并且优化了该系统的大小及转化条件。利用该系统在牛支原体中成功的表达了外源及内源蛋白。同时,检测了两种细胞膜相关蛋白对牛肾细胞的黏附及诱导凋亡的影响。随着牛支原体基因组序列拼接的完成,构建的自我复制载体系统为研究牛支原体相关基因的功能及致病机理提供了良好的平台。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.62
【图文】：

煎蛋,支原体

发现的有机体是一种病毒或者是L型细圼[3]。由于生长在固体平板培养基上的支原体在显微镜下观察呈现典型的“煎蛋”状圼落（图1-1)，因此对支原体的分类争议一直持续到二十世纪60年代[3]0Sectioned colortyf Central zonePeripheral mm 《}0be_d in agar)(agar surface)\ ^ ? * ? ? ? ? \{ * ? ? ? I\ ? ? \t\wy ? ? /V ? ? ? ? ? * tt g?????.? ^Surface of colonyC^fffed tgg" appearance)图1-1支原体“煎蛋”状形态的图解⑷Figure 1-1 Diagram of “fried-egg” morphology⑷事实上，支原体属于柔膜菌纲、支原体R、支原体科[5-7]，是柔膜菌纲中最大的种属。柔膜菌是?类由革兰氏阳性细菌分支演化而来的，没有细胞壁的微生物[8'9]。通常人们会认为，没有细胞壁的微生物应该属于革兰氏阴性菌。尽管如此，柔膜菌纲的微生物在进化学角度与革兰氏阳性菌更为相关，即杆菌纲和梭菌纲。16S rRNA序列同源性分析是最常用的细菌进化树分析方法[">“\尽管存在数十年的争论

支原体,宿主,纤维

细胞质巾生存[91]。尽管关于支原体逃避宿主吞唾作用的以上所有方法尚没有全部确认，但在牛支原体的入侵中，其很可能是利用以上方式[91]。图1-3显示了支原体是如何在宿主细胞吞II过程的各阶段中逃避的[911。Extr^^lular Z ^/ b、-\ (p) \彟” I \ (b)/ 丨 ntfac?丨 Mar图1-3支原体在逃避宿主吞唾作用的各阶段(a)支原体的炥附和存j作用可能被纤维所组成的结构，抗存喷蛋的存在或荚膜结构所抑制，也Bj■能是由r其、免疫球蛋白Fc蛋白的结合或定殖在纤毛和细胞质见使其难以到达存晚细胞所致；（b)支原体的蛋m酶、a愔琠和产生的氧化自由基可能会影响吞唾体膜结构的完整性，呼吸道吞唾细胞的新陈代谢和活性；（C)支原体产生的l#类物质可能会对吞唾体-溶》体结合物造成损害；（d)支原体可能会从吞哩作用中存活下来，逃避至细胞质中（机制尚不明确）；(e)支原体在吞唾体-溶酶体结合物中存活下来是太可能的[91】。6

支原体,动力学,乳房炎

响因素是否会对疾病的状况产生影响尚不明确[“7】。基于以上这些报道，污染物可能是牛支原体感染的重要来源。图1-4是Maunsell和Donovanl8、！出的牛支原体传播方式及秘牛的传染病动力学。mm. a. ^Mfosols， /蔡II gF^eiiBSpf前df卿师 Kyj^Jmm图1-4牛支原体在j牛中的传播和感染动力学Figure 1-4 Proposed Transmission and infection dynamics in young calves (URT, upper respiratory tract)[R[支)?体所引起的呼吸道疾病，即使在临床上没有明显的感染症状，感染动物可能会作为带菌者向外持续散布病原数月甚至数年lis]。呼吸道感染的传播途径可能是直接接触、飞沫、气溶胶或依靠自然风力传播115]。患有有牛支原体感染引起的乳房炎的乳卞?所怀胎儿和生产後牛会通过母体子宫或者在出生过程中感染，证明了牛支原体垂直传播的可能性同时，也有报道证明了接牛见的横向传播另外，感染的扩散也可能在器宫之间发生[I2、在这些报道中，乳房炎和关节炎的发生都是在呼吸系统产生疾病之后有许多试验研究农明，将接牛、小母牛和成牛乳牛词养在一起时，当有明显的呼吸系统疾病发生后大约一个月，成年母牛发生乳房炎，而接牛和小母牛患有关节炎尽早对感染动物进行诊断，挑选出带菌动物和患病动物

【共引文献】