绵羊乳腺组织RNA-Seq及STAT5a基因遗传特征分析

发布时间：2020-08-28 16:30

　　 乳腺是具有泌乳功能的特殊腺体。在哺乳动物繁殖过程中,泌乳性能影响了后代的成活率和生长速度。哺乳动物的泌乳规律性变化(如泌乳量的高低、乳成分的变化等)取决于乳腺组织中相关基因的差异性表达。调控绵羊乳腺性能的功能基因及其分子机制仍需要进一步探讨。本研究选择年龄、胎次、饲养管理条件相同的3只多羔绵羊品种(小尾寒羊)与3只单羔绵羊品种(甘肃高山细毛羊)作为研究对象,屠宰后采集泌乳高峰期乳腺组织(产后3周),采用高通量二代测序技术对2个品种的乳腺组织进行转录组测序(RNA-Seq),筛选出品种间的差异表达基因,分析这些基因的GO和KEGG功能富集,鉴定品种间的新mRNA转录本、SNP和Indels。同时,以筛选出的STAT5a作为候选基因,应用qRT-PCR和PCR-SSCP技术,分析STAT5a基因的组织表达和核苷酸序列变异特征。主要研究结果如下:1.小尾寒羊和甘肃高山细毛羊泌乳高峰期乳腺的转录组特征。在6个乳腺组织RNA测序文库中分别得到约139 M(million)的原始读段(Raw Reads),碱基识别准确率均在99%以上,通过质控后,约76.62%的Clean Reads和15041个基因被注释到绵羊参考基因组上。在2个绵羊品种间,共筛选出226个差异表达基因,其中上调基因75个,下调基因151个。随机选择13个差异表达基因(包括7个上调基因和6个下调基因),qRT-PCR发现这些基因在2个绵羊品种间的差异表达趋势与RNA-Seq研究结果相一致,表明本研究中的RNA-seq具有很高的准确性。GO和KEGG功能富集分析发现,这些差异表达基因主要参与钠离子转运、血管平滑肌收缩、PI3K-Akt信号通路和Notch信号通路等。转录本结构分析表明,小尾寒羊乳腺组织中存在170436个转录本,其中155040个为新转录本,364516个SNPs和42506个Indels。甘肃高山细毛羊中存在174336个转录本,其中158847个为新转录本,397044个SNPs和49012个Indels。2.STAT5a基因表达特征和核苷酸序列变异特征。STAT5a基因在绵羊7个组织中均有表达,并表现出明显的品种差异性和组织差异性,在藏绵羊和小尾寒羊中,STAT5a基因在乳腺组织中的表达量显著高于其它6个组织(P0.01),而2个品种之间,小尾寒羊乳腺组织的表达量显著高于藏绵羊(P0.05),但在肝脏、肺脏、肾脏和小脑的表达量显著低于藏绵羊(P0.05);PCR-SSCP分析表明,绵羊STAT5a基因的第10内含子、第12外显子和第15内含子上都存在2个等位基因和1个(c.1169+84 AG)、1个(c.1308 AG,为同义突变)和2个SNPs(c.2150-154 CT和c.2150-50 TC)。在第10内含子和第12外显子上,3个绵羊品种的多态信息含量均处于中度多态,藏绵羊处于Hardy-Weinberg平衡状态,湖羊和多浪羊偏离了Hardy-Weinberg平衡状态;在第15内含子上,藏绵羊属于中度多态,湖羊和多浪羊属于低度多态。3个绵羊群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。本研究筛选出了多羔和单羔绵羊品种间的差异表达基因,明确了调控不同产羔数品种间泌乳性能的生物学途径,获得了泌乳性状相关基因STAT5a基因的组织表达和核苷酸序列变异特征。结果可作为阐释绵羊泌乳性状分子改良的理论基础,也丰富了绵羊基因组学的研究结果。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S826
【部分图文】：

图 1 信息分析流程Figure 1 information analysis process1.6.1 原始数据的质量控制、过滤及序列比对采用 FastQC（http://en. wikipedia.org/wiki/FASTQ_format）对下机数据进行质控后获得 Clean reads。应用 Bowite 2 建立参考基因组索引，然后使用 Tophat2 将过滤后的 Reads 比对到参考基因组（Ensemble 数据库的 Ovis_aries.Oar_v3.1.dna.toplevel.fa），应用 HiSeq 软件对 reads count 数进行统计分析[48, 49]。1.6.2 基因表达水平及差异分析将唯一比对到参考基因组上的 reads 用于基因表达量统计分析。应用每百万片段中来自某一基因每千碱基 reads 数目（RPKM）算法对每个样本中基因的表达量进行量化。当 RPKM 值大于 0.01 时被认为该基因在组织中表达[50]。差异表达分析之前，运用 SPSS19.0 检验样品间基因的表达模式相关性。采用 DESeq（version 1.18.0）对基因表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件为：表达倍

第三章 结果与分析组学分析A 提取结果了 3 只小尾寒羊和 3 只甘肃高山细毛羊的乳腺组织共 6 个样A 的提取。总 RNA 的纯度和浓度采用 NanoDrop 2000（Th）检测，完整性采用 1.5 %甲醛变性的琼脂糖凝胶电泳检测。总 RNA 完整性较好，纯度较高（检测结果如图 2）。本试验 5S、18S 和 28S 三条带，没有其他杂带，且无拖尾现象，无度检测显示 A260/A280 均处于 1.9~2.0 之间。RNA 文库经求，可用于后续试验。

表 5 数据过滤统计Table 5 Statistical data filteringSample Clean resds Clean data Clean resds（%） CleanGB1_5 141244574 20882221354 99.23 GB2_8 139563102 20659945012 99.36 GB3_4 139407058 20516397494 99.26 XB1 140828556 20773788910 99.30 XB2_7 136465766 20125833522 99.33 XB3_8 136990336 20195805086 99.19 ：Sample：样品名；其中，GB 为哺乳期甘肃高山细毛羊乳腺组织，XB 为哺乳期小尾寒羊乳腺组织；Clean Reads：高质量序列 read 数；Clean Data（bp）：高质量序列碱基数；Clean Reads %：高质量序列 reads 占测序 reads 的百分比；Clean Data %：高质量序列碱基占测序碱基的百分比；通过单碱基质量、Base Content分布、GC Content分布和Sequence Ba布对测序结果进行质量评估。测序数据的单碱基质量分布图是用来评碱基的测序准确性。一般测序的 5'端和 3'端的碱基质量较低，中间部序质量较高。对测序结果质控分析发现，大部分序列的碱基质量在 Q明碱基识别准确率在 99 %以上，测序质量可行度较高（图 3）。

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本文编号：2807836