少孢节丛孢菌Aoz1基因及其启动子的研究

发布时间：2020-09-02 14:08

　　近年来,兽用化学驱虫药的不合理使用现象普遍,导致家畜寄生虫病的防治问题凸显,其中尤以寄生性线虫为甚,给我国畜牧业带来了不可估量的经济损失。因此开发一种安全无副作用的新型治疗家畜线虫病的方法显得尤为重要。值得欣喜的是,相关学者们通过不懈努力,终于发现线虫的天敌——捕食线虫性真菌对家畜线虫病的防制具有良好的应用前景。多年来的研究发现,捕食线虫性真菌在对线虫的侵入和消解等过程中能够分泌多种胞外蛋白酶,其中就包括丝氨酸蛋白酶。为获得该酶的基因和启动子信息,进而为后续有关蛋白酶和捕食线虫性真菌杀灭寄生性线虫机理方面的研究提供参考资料,本研究拟以捕食线虫性真菌的代表种—少孢节丛孢菌内蒙古株胞外丝氨酸蛋白酶的基因及其启动子进行了发掘及初步分析研究,研究结果如下:(1)先扩增少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶的编码序列并构建至原核表达载体pET32a中,再转化至Transetta(DE3)表达感受态中,进行表达条件的优化以及表达产物的纯化。结果表明:少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因可以在原核系统中表达,其最适IPTG诱导浓度为1.5mmol/L,最佳诱导时间为8h,并对重组蛋白进行了纯化。(2)以少孢节丛孢菌基因组及少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因(Aoz1)为基础,利用BLAST对两者进行比对,进而找到少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因Aoz1起始密码子上游侧翼序列,据此设计引物扩增和克隆该片段并测序,然后用启动子在线分析软件Promoter Scan、NNPP、Promoter 2.0及CpG岛在线预测软件EMBOSS和Meth Primer对所得序列进行分析;结果表明,所得序列长度为2009bp,与原始序列比对后发现同源性为96%;在少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶Aoz1基因起始密码子上游2009bp中存在启动子的基本结构TATA框、转录起始位点TSS、转录因子结合位点及CpG岛等结构。(3)构建重组萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-P1和5'端缺失重组载体pGL3-Basic-P2和pGL3-Basic-P3后,分别转染至HEK-293T细胞与HeLa细胞中,进行双荧光素酶报告基因检测。结果表明:少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶Aoz1基因起始密码子上游2009bp(P1)分别在HEK-293T细胞与HeLa细胞中能显著增强萤火虫荧光素酶报告基因的表达活性,确定少孢节丛孢菌Aoz1基因的核心启动子区可能位于序列P1中,为后续进行少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的研究和少孢节丛孢菌捕食机理的研究奠定了坚实的基础。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S855.9
【部分图文】：

过程图,启动子,原核生物,RNA聚合酶

有组织中的表达，并且表达量基本维持恒定。对于某些丝状真菌，利表达异源基因意义重大[39]，如构巢曲霉中的gpd A启动子就属于组成异源基因的高效表达[40]；此外，在高等植物的转基因工程中也有较多杆菌中的Nos启动子，椰菜花叶病毒(CoYMV)的35S启动子和Ocs启性表达启动子，即只能驱动基因在部分处于某种生理活动中特定的组达。研究发现，这类启动子的结构较为复杂，不仅包括一般启动子括位于上游的调控位点及增强子和沉默子等特殊结构[38]。目前，已报表达型启动子绝大多数都存在于植物，如叶片特异型启动子(Fiemin粉特异型启动子(Hamilton et al.1995)和果实特异型启动子(Yam[42]。诱导型启动子，是指在某些物理或化学因素的刺激下，对其下显增强作用的一类启动子。这种类型的启动子的调控机制通常会受到，如果没有诱导物质的存在，其很难发挥调控功能。根据诱导物的不子可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导和真菌诱导表达基因启动子等[43]。

过程图,RNA聚合酶,启动子,过程

DNA 双链被解旋后顺利进入到转录的部位而开始合成，原核生物基图 1[44]。对于真核生物的启动子，根据所结合的 RNA 聚合酶的种类以及真核基产物，可将其分为四类：一是Ⅰ型启动子，由 RNA 聚合酶 I 参与转录，录；二是Ⅱ型启动子，由 RNA 聚合酶Ⅱ参与转录，负责 snRNA 和蛋白Ⅲ型启动子，由 RNA 聚合酶Ⅲ参与转录，负责 tRNA 和 SSRNA 的转启动子，可与新近报道的 RNA 聚合酶 IV 结合，该酶为植物所特有，IVb 两种形式，可参与 RNA 聚合酶 I 介导的 DNA 甲基化及染色质的修默基因转录[43]。在上述四种启动子中，结构最复杂的为Ⅱ型启动子，一，一是转录起始位点，大多数为碱基 A；二是 TATA 框，处于起始位点多的 AT 碱基，由于其最早被 Hogness 发现，所以又被称为 Hogness 框它是真核生物启动子的核心调控元件，位于－20~－30bp 处（高等生物00bp（低等真核生物）；三是 CAAT 框，共有序列为 GGNCAATCT，功能一致，同为 RNA 聚合酶Ⅱ的结合区；四是能提高转录效率的增强

PCR扩增条件

图 3 Aoz1 基因的 PCR 扩增条件Fig.3 The PCR amplification condition ofAoz1 gene反应结束后，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。然后，采用胶化 Aoz1 目的片段，具体参见天根普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书得到的片段进行电泳检测，并使用微量分光光度计（NanoDrop2000）检测纯度。在此基础上，进行 Aoz1 基因与平末端克隆载体 pEASY-Blunt 的连。将经 PCR 鉴定的单克隆经菌落培养于含氨苄青霉素的 LB 液体中，37℃，夜培养后，将菌液送至华大基因测序。.2.3 Aoz1 基因原核表达载体的构建将测序正确的菌液进行质粒抽提，详细过程参照 Axygen 质粒小提试剂进行；然后使用 BamHⅠ和 HindⅢ对重组质粒 pEASY-Blunt-Aoz1 和 pET行双酶切。对经酶切的重组质粒 pEASY-Blunt-Aoz1 进行电泳，并切胶回段。对酶切后的 pET32a 载体用 EasyPure PCR Easypure PCR Purification

【参考文献】