牛ANGPTL5基因遗传多态性分析及对牛乳腺上皮和前体脂肪细胞甘油三脂含量的影响

发布时间：2020-09-11 12:06

　　 血管生成素样蛋白5(ANGPTL5)为ANGPTLs家族成员,主要表达于心脏、脂肪组织。目前,研究显示ANGPTL5参与体内血管生成,同时其在调节脂质合成与代谢方面也发挥着重要作用。本课题组前期研究结果显示,在日本和牛内脏脂肪和皮下脂肪中ANGPTL5表达水平存在显著差异,表明ANGPTL5基因很可能参与并影响牛机体内脂肪沉积。因此,本试验以ANGPTL5作为影响牛脂肪代谢的候选基因,在中国西门塔尔牛和中国荷斯坦奶牛群体中对ANGPTL5基因的遗传多态性进行检测,并统计分析ANGPTL5基因的SNPs位点与乳品质性状和肉品质性状的相关性。为进一步研究ANGPTL5基因对牛脂肪代谢的影响,通过实时荧光定量PCR扩增,检测了牛脂肪组织、肌肉组织和各器官以及前体脂肪细胞中的表达水平。在细胞水平上,将构建的p BI-CMV3-ANGPTL5基因过表达载体和sh RNA干扰载体分别转染牛乳腺上皮和前体脂肪细胞,检测ANGPTL5基因对细胞内甘油三酯含量的影响。实验结果显示,在中国荷斯坦奶牛群体中共筛查到三个SNPs位点,分别为I1-1776GA位点、I5-2743AC位点和I5-2757TC位点。其中,I5-2743AC和I5-2757TC位点与中国荷斯坦牛产奶和乳品质性状没有相关关系;I1-1776GA位点与中国荷斯坦牛尿素氮含量显著相关(p0.05)。在中国西门塔尔肉牛群体中,检测到了四个SNPs位点,分别为I1-1776GA、I2-77TC、I2-1505AT和I2-1391CT位点。其中,I1-1776GA位点与中国西门塔尔牛前蹄重、后蹄重、肝脏重、脾脏重、背膘厚呈显著相关关系(p0.05);I2-1391CT位点与中国西门塔尔牛前蹄重、后蹄重、肝脏重、脾脏重、背膘厚呈显著相关关系(p0.05);I2-1391CT和I2-1505AT位点与中国西门塔尔牛背膘厚呈显著相关关系(p0.05)。ANGPTL5基因在心脏中的表达水平最高,肝脏中的表达水平最低。前体脂肪细胞中ANGPTL5表达水平,显著低于乳腺上皮细胞的表达水平,皮下脂肪和内脏脂肪中的基因表达水平显著高于前体脂肪细胞。在过表达牛ANGPTL5基因的牛前体脂肪细胞和乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量显著升高(p0.05),而在ANGPTL5基因沉默的牛前体脂肪细胞中甘油三酯的含量显著下降(p0.05),ANGPTL5基因沉默的牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量显著升高(p0.05)。综上所述,本试验结果表明ANGPTL5基因内含子区域的SNPs位点与牛肉质、胴体和乳品质性状均存在显著相关性;ANGPTL5基因表达促进细胞内甘油三酯合成。以上研究结果为解析ANGPTL5对脂肪代谢的功能提供研究基础,也为牛乳品质和肉品质改良以及分子育种提供功能基因和遗传标记。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S823
【部分图文】：

图 1.1 血液基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果注：1~6.中国荷斯坦奶牛血液基因组 DNAThe agarose electrophoresis result of bovine blood genNote：1~6. The genomic DNA of Chinese Holstein cow blood增结果取基因组 DNA 为模板，用设计的 6 对引物进行扩增2、3、4、6 泳道 PCR 产物长度与预期相符，条带均 泳道 PCR 产物有两条带，引物特异性不好，产生非续胶回收测序，结果见图 1.2。

PTL5 基因中国荷斯坦奶牛混池模板 PCR 产物琼脂糖注：M.DL2000Marker, 1～6.PCR 产物。he result of PCR amplification of ANGPTL5 gene in Chindairy cowsNote: M. DL2000 marker, 1～6. Production of PCR.斯坦奶牛群体中 ANGPLT5 基因 SNPs 位点筛查 PCR 扩增后送金唯智测序，通过分析混池测序结果R 产物中存在一处明显的双峰，是 I1-1776 处的 G>A 荷斯坦奶牛群体中，ANGPTL5 基因在这两个位点具果见图 1.3，引物 6 扩增的 PCR 产物中存在两处明显 处的 A>C 颠换和 I5-2757 处的 T>C 转换，由此可得，和 SNPs 位点筛查测序，在中国荷斯坦奶牛群体中针对个 SNPs 位点。

图 1.3 中国荷斯坦牛 ANGPTL5 基因混池 PCR 产物测序结果注：A. I1-1776 G>A 位点测序图，B. I5-2743A>C 位点测序图，C .I5-2757 T>C 位点测序图。Fig 1.3 The sequencing results of ANGPTL5 gene for Chinese Holstein dairy cowssamplesNote: A. I1-1776 G>A sequencing result, B.I5-2743 A>C locus sequencing result, C.I5-2757 T>Clocus sequencing result.基于在混池测序结果中发现，在引物 E6 扩增的 PCR 产物中存在两个 SNPs位点，而且片段大小适中，能够通过一个测序反应同时对两个位点进行检测，因此选用直接测序的方法来检测该中国荷斯坦奶牛群体的 SNP。进行该群体单个样品 PCR 扩增后，将部分产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，选取电泳条带清晰均一，无二聚体和抹带的PCR产物送测序，共对103个样本进行测序。最终，I5-2743A>C位点获得 96 个有效结果，I5-2757T>C 位点也获得了 96 个有效结果。对引物 2扩增的PCR产物也采取直接测序的方法，共对116个样本进行测序，最终，I1-1776G>A 位点获得 113 个有效结果。各 SNPs 不同基因型部分测序结果如图 1.4 所示。

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本文编号：2816652