牛、羊Viperin基因的克

发布时间：2020-09-11 21:44

　　蓝舌病(Bluetongue)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一种严重侵害绵羊、牛和鹿等反刍动物的、有虫媒传播的急性非接触性传染病。近年来蓝舌病在欧洲数次暴发,引起了重大经济损失。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须申报的动物传染病。Viperin蛋白是2001年发现的一种干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs),能被多种病毒甚至细菌诱导表达,并且已证实具有抑制病毒复制、免疫调节和代谢调节的功能。但是目前未见Viperin蛋白抑制BTV复制的相关报道。本研究利用RT-PCR方法从原代绵羊睾丸(PST)细胞和牛肾细胞(MDBK)中扩增牛、羊Viperin基因,利用分子生物学软件对其进行生物信息学分析和预测,然后构建真核表达载体,将其转染细胞后评价两种Viperin蛋白在BTV复制过程中的作用。本实验首先利用实时定量PCR分析了BTV感染后Viperin基因转录水平的变化,结果显示,BTV感染的PST、MDBK细胞以及绵羊血液中Viperin基因的转录水平均明显升高。参考已公布的牛、羊Viperin mRNA序列设计引物,从BTV感染的PST和MDBK细胞中提取总RNA,RTPCR扩增得到与预期大小相符的条带,将其与pMD18-T载体连接后进行序列测定,结果表明,牛、羊Viperin基因的开放阅读框(ORF)均由1092对碱基组成。序列分析发现,牛、羊Viperin蛋白与其它物种的Viperin结构非常相似,均含有N末端、S-腺苷-L-甲硫氨酸(radical S-adenosyl methionine,SAM)和C末端结构域,亮氨酸拉链(leucine zipper)和SAM结构域中的基序序列高度保守。进化树分析表明,牛、羊Viperin与羊驼、野牦牛和藏羚羊等反刍动物Viperin遗传关系较近,与其它动物Viperin的遗传关系较远。VP5是BTV外层衣壳的重要组成蛋白,具有膜渗透功能,介导病毒粒子从内吞体释放进入细胞质。本实验实现了VP5 N端缺少41个氨基酸的截短蛋白VP5?41aa在大肠杆菌表达系统中的高效表达和纯化,将其免疫新西兰白兔后制备了多克隆抗体,Western blot和细胞免疫荧光实验表明,该抗体不仅能与重组表达的VP5?41aa蛋白反应,而且能与BTV感染细胞中具有天然构象的VP5蛋白反应,为后续评价病毒复制效率提供了重要的抗体检测工具,也为深入研究VP5蛋白的生物学功能奠定了基础。为了进一步研究牛、羊Viperin在BTV感染过程中的作用,将牛、羊Viperin基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了带有Flag标签的牛、羊Viperin基因真核表达质粒,分别转染BHK-21细胞,评价其对BTV复制效率的影响。结果显示,牛、羊Viperin蛋白在BHK-21细胞中成功表达,与对照组相比,表达牛、羊Viperin的细胞中,BTV结构蛋白VP5、VP6以及非结构蛋白NS1表达量明显下降。实时定量PCR显示,过表达Viperin蛋白可以有效降低BTV NS3mRNA的水平。蚀斑分析结果进一步证实,牛、羊Viperin基因过表达明显降低了病毒滴度。以上研究表明牛、羊Viperin均可有效抑制BTV的复制,在抗BTV感染的过程中可能发挥重要作用。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

示意图,蓝舌病毒,传播途径,二次

主要传播媒介为库蠓、虱、伊蚊等吸血昆虫(孙恩成,2014)，媒介昆虫一旦感染，终生带毒（图1.1），也有报道称BTV可经过胎盘垂直传播给胎儿(Wilsonetal.,2009)。由于蓝舌病可对畜牧业贸易造成重大威胁，OIE将其列为法定通报动物疫病，在我国属于一类动物传染病(林汉亮等，2008)。该病的主要临床症状为稽留热，口腔、肠道粘膜卡他性炎症，病畜的典型症状为口舌、面部肿胀，甚至糜烂发绀，故称作蓝舌病。图 1.1 蓝舌病毒传播示意图以及可能的二次传播途径(Wilson et al., 2009)Figure 1.1 The transmission of bluetongue virus, showing putative secondary transmission routes(Wilson et al., 2009)早在18世纪，非洲大陆就有类似于BT症状的绵羊传染病的记载，直到1905年

示意图,基因组分,粒子结构,蛋白

图 1.2 BTV 粒子结构蛋白和基因组分布示意图.1.2 Schematic diagram of the structure of the BTV 色），内层核心衣壳蛋白 VP7 和 VP3（绿色与红色），核心色），基因组双链 RNA（蓝色）(Mertens et al., 2004 (purple and yellow), inner-coat VP7 and VP3(green and red), green), genomic double stranded RNA(blue)(Mertens et心蛋白 VP3 和 VP7 构成，两种蛋白都具3KDa）蛋白有两种构像，二者折叠方式不合体紧密结合在 VP3 分子下方，同时，白具有自组装功能，因其在病毒组装中的度保守(Tanaka et al., 1994)。VP7（38KD不同血清型的氨基酸序列同源性达到 90的 VP7 蛋白和针对 VP7 蛋白的抗体为基同样具有自组装功能，VP3 和 VP7 蛋白在心样颗粒（core-like particles，CLPs）(N

示意图,蛋白组,粒子,顺序

中国农业科学院硕士学位论文第一章引言期蛋白，可在宿主细胞的胞质中合成并形成微管样结构，NS1蛋白直接与BTV ssRNA 3'端UTR的ACUUAC六核苷酸片段作用，促进其它病毒蛋白的合成，提高病毒滴度(Boyce et al., 2012)。NS2（42KDa）几乎与NS1同时合成，可招募其它病毒蛋白形成病毒包涵体（Viral inclusion bodies，VIB），NS2具有多个特异结合ssRNA的位点和三磷酸核苷水解酶活性，在BTV十段RNA链的识别和组装过程中起重要作用(Modrof et al., 2005)。 NS3（26KDa）和NS3a（24KDa）是BTV基因编码的两种膜蛋白，可增加宿主细胞膜的通透性以帮助BTV出芽，同时，在病毒的转运、成熟中也发挥重要作用(Fengetal.,2013)。NS4（17KDa）通过抑制各种启动子的活性，阻碍宿主细胞干扰素（Interferon，IFN）mRNA的合成和干扰素刺激基因的表达，发挥免疫逃逸作用(Ratinier et al.,2016)。

【参考文献】