交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定

发布时间：2020-09-16 17:31

　　鸭甲型肝炎(Duck hepatitis A,DHA)是危害养鸭业的主要疾病之一,可引起雏鸭的急性、高度致死性的传染病。根据其基因序列的差异,分为三个基因型(DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C),目前我国主要流行DHAV-A和DHAV-C,两种基因型病毒缺乏有效的交叉中和作用,严重影响本病的防控。研究表明,针对保守中和抗原表位的广谱中和抗体是应对这种情况的新策略。本研究拟针对DHAV-A和DHAV-C共同保护性抗原的保守序列研制单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb),进而筛选出针对这两种基因型DHAV的广谱中和抗体,取得如下成果:1研制出与DHAV-A和DHAV-C具有交叉反应性的单克隆抗体根据DHAV-A和DHAV-C的VP1蛋白共有的氨基酸序列,利用生物信息学软件设计筛选出评分最高的12条长度为14肽的抗原表位,人工合成各肽段,分别与KLH载体蛋白偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb,获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测结果显示,其中6株McAb(C1、C4、C7、C12、C13、C16)同时与DHAV-A和DHAV-C发生交叉反应,而不与鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)反应,为广谱中和McAb的筛选奠定了基础。2筛选出具有交叉中和活性的单克隆抗体2.1 McAb在鸭胚中的交叉中和活性为评价McAb的中和活性,将具有交叉反应性McAb分别与200ELD_(50)DHAV-A和DHAV-C等体积混,接种12日龄SPF鸭胚绒毛尿囊腔,0.2mL/胚,进行中和试验,每个处理组5枚鸭胚,以鸭β-actin基因作为内参,采用Real-time PCR方法测定病毒荷载量,用2~(-△△CT)法进行相对定量,评价6株具有交叉反应性的McAb对DHAV-A和DHAV-C的在鸭胚上的中和活性,并测定其中和效价。结果显示,6株McAb对DHAV-A和DHAV-C增殖的抑制率依次为:C1(84.4%82.69%)、C4(90.79%75.34%)、C7(86.23%99.83%)、C12(14.74%25.26%)、C13(38.87%2.06%)和C16(99.61%100%)。鸭胚中和试验结果中,6株McAb对DHAV-A、DHAV-C的中和效价分别为:C1(1:31:5)、C4(1:31:3)、C7(1:101:11)、C12(00)、C13(00)和C16(1:91:9)。据此筛选出4株(C1、C4、C7、C16)具有交叉中和活性的McAb。2.2 McAb对雏鸭的预防效果为了解4株对DHAV-A、DHAV-C具有交叉中和活性McAbs对雏鸭的交叉预防效果,1日龄雏鸭分组肌肉注射McAb,1mL/只,24 h后分别肌注DHAV-A、DHAV-C,100ELD_(50)/只,每个处理组5只雏鸭。结果显示,4株McAb对DHAV-A、DHAV-C的保护率分别为:C1(30%40%)、C4(40%40%)、C7(70%80%)、C16(100%60%)。本研究结果显示,4株McAbs对两种不同基因型毒株均具有不同程度的交叉预防效果,其中C7、C16对DHAV-A和DHAV-C的攻击具良好的交叉预防作用,保护率达60%以上。
【学位单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

氨基酸序列,表位,氨基酸序列,蛋白

图1 DHAV-A和DHAV-CVP1 蛋白共有表位氨基酸序列的分析结果Fig.1 Epitope analysis of VP1 amino acid sequences shared by DHAV-Aand DHAV-C表2 共有抗原表位的信息

杂交瘤细胞株,生长形态

图 2 杂交瘤细胞株生长形态(100×) A:第1代；B:第5代；C:第15代；D:第20代Figure 2 Hybridoma cell line growth morphology (100×) A: 1st generation; B: 5thgeneration; C: 15th generation; D: 20th generation 讨论

雏鸭,生存曲线,病毒感染

图 4 DHAV-A 攻毒组雏鸭生存曲线Fig.4 Duck survival curve of DHAV-A virus challenge group图 5 DHAV-C 攻毒组雏鸭生存曲线Fig.5 Duck survival curve of DHAV-C virus challenge group从表 14、15 中可以看出 C7 和 C16 对两种基因型病毒感染雏鸭都具有良好

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