基于转录组学分析的饲粮能量限制调控肉鸡免疫机能的分子机理

发布时间：2020-09-22 07:48

　　由于大量的脂肪沉积以及新陈代谢失调导致的肉鸡屠宰品质不佳、免疫力低下、死亡率增加,猝死症、腹水症等与代谢相关疾病频发等,给生产造成非常大的困扰和经济损失。已有很多研究证明,采用适度水平的限制饲养可有效的改善上述问题,同时哺乳动物最近的研究发现,免疫与代谢在生理及疾病中的相互影响。一方面,大量的能量摄入产生代谢与免疫方面的异常,另一方面,免疫细胞(如淋巴细胞和白细胞)在多层面受到内部能量代谢的调节。这种存在于免疫应答和能量代谢之间的相互作用,揭示了正确调节和管理能量摄入,保持两者之间微妙的平衡对于机体健康至关重要。因此能量限制对于增进健康和延长寿命的机制一直受到密切关注,虽然相关研究已扩展到很多动物模型动物,但究其分子机制仍有争议。同样能量限制对于肉鸡免疫器官的分子效应以及免疫和代谢之间的相互作用尚缺乏研究报道。为了研究能量限制对肉鸡免疫机能影响的分子机理,本研究在饲养试验的基础上以肉鸡脾脏为研究对象,通过高通量测序技术筛选能量限制诱发的脾脏差异表达基因并进行生物信息学综合分析,结合能量限制引起的肉鸡生长性能、免疫机能表观效应探索能量限制增强机体免疫机能的分子机理,阐明能量限制增进动物健康和延长寿命的潜在机制。本研究从以下三个方面进行试验研究:试验一,能量限制对肉鸡生长性能及免疫机能的影响采用单因素试验设计,选用健康的22日龄雄性科宝(Cobb)肉鸡72只,逐只称重后,随机分为对照组(不限能)、试验1组(限能15%)和试验2组(限能30%)。每个试验处理组24只鸡,每只鸡单笼饲养(每只鸡为一个重复)。分别在28日龄和42日龄屠宰。研究不同水平能量限制对科宝肉鸡生长性能、免疫器官指数及外周血淋巴细胞浓度等的影响,试验结果如下:(1)28日龄,末重、日均采食量和日增重对照组均显著高于试验1组和试验2组(P0.05)、试验1组显著高于试验2组(P0.05),料重比对照组与试验1组和试验2组比较差异不显著(P0.05);42日龄,末重、日均采食量和日增重对照组显著高于试验1、2组(P0.05),试验1组显著高于试验2组(P0.05),料重比试验2组显著高于试验1组和对照组(P0.05),试验1组和对照组比较差异不显著(P0.05)。(2)28日龄,鸡法氏囊指数试验2组显著大于试验1组和对照组(P0.05),试验1组和对照组比较差异不显著(P0.05);胸腺指数和脾脏指数三个处理组之间没有差异。42日龄,脾脏指数试验2组显著大于试验1组和对照组(P0.05);法氏囊指数及胸腺指数三个处理组之间差异不显著(P0.05)。(3)28日龄,血清中免疫球蛋白IgM的含量试验1组和试验2组显著高于对照组(P0.05),试验1组和试验2组比较差异不显著(P0.05)。IgG三个处理组之间差异不显著(P0.05)。IgA试验2组显著高于对照组(P0.05)。42日龄,IgM的含量三个处理组之间差异不显著(P0.05),IgG、IgA的含量试验1组和试验2组显著高于对照组(P0.05),两个试验组之间没有差异。(4)28日龄时CD3+和CD4+淋巴细胞的比例,对照组与两个试验组比较有升高的趋势,但没有达到显著水平(P0.05),而CD8+淋巴细胞试验2组显著高于对照组和试验1组(P0.05),对照组和试验1组之间没有差异(P0.05)。42日龄,CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞对照组和试验1组、试验2组比较差异不显著(P0.05),但都有升高的趋势。(5)28日龄,血清中葡萄糖、甘油三酯和低密度脂蛋白在三个处理间差异不显著(P0.05);总胆固醇含量,试验2组显著低于对照组(P0.05);高密度脂蛋白含量试验1组和试验2组显著低于对照组(P0.05),试验2组显著低于试验1组(P0.05)。在42日龄,葡糖糖、低密度脂蛋白三个处理组之间没有差异,胆固醇含量试验2组显著低于对照组(P0.05),甘油三脂含量试验2组显著低于试验1组和对照组(P0.05),试验1组和对照组比较差异不显著(P0.05)。结果表明能量限制降低了肉鸡的生产性能,改善了肉鸡脂类代谢及免疫机能。试验二能量限制致鸡脾脏差异表达基因的功能注释与分析分别选取28、42日龄脾脏提取总RNA,采用高通量测序技术进行转录组测序,筛选差异基因并进行生物信息学分析。结果显示:(1)28日龄,试验1组共有26个基因差异表达,试验2组有70条基因差异表达。42日龄,试验1组141个基因差异基,试验2组108个基因差异表达。(2)28日龄试验1组和试验2组与对照组比较有15条共同差异表达基因;42日龄试验1组和试验2组与对照组比较共有29条共同差异表达基因。(3)对差异基因进行GO分析发现:28日龄,试验1组和对照组比较差异基因没有显著富集的GO条目,试验2组和对照组差异基因主要富集到趋化因子活性、趋化因子受体结合、细胞因子受体结合、脂肪酸应答、免疫应答、刺激应答及免疫过程这些与免疫及脂类代谢相关的生物学过程。42日龄,试验1组和对照组比较,显著富集的差异基因主要参与的生物学过程包括脂类代谢、蛋白质折叠、蛋白质糖基化以及抗原加工提呈等;试验2组和对照组比较差异基因主要富集在核糖核酸酶活性、趋化因子受体结合、趋化因子活性及细胞凋亡过程等。(4)经过KEGG通路分析发现:28日龄试验1组和对照组比较差异基因主要富集在肠道免疫网络IgA产生通路以及细胞因子和细胞因子受体相互作用通路,试验2组和对照组比较主要富集到的通路有:A型流感、粘着斑、细胞外基质受体相互作用、细胞因子和细胞因子受体相互作用通路、mTOR信号通路、Toll-like受体信号通路以及Jak-STAT等通路,但均未达到显著富集。42日龄试验1组和对照组比较差异基因主要富集在蛋白质内质网加工通路、肠道产生IgA免疫网络等通路其中显著富集在蛋白质内质网加工通路。试验2组和对照组差异基因主要富集于细胞因子和细胞因子受体相互作用通路、肠道免疫网络IgA产生通路、吞噬体通路以及调节肌动蛋白骨架通路,其中显著富集于细胞因子和细胞因子受体相互作用通路。这些结果显示能量限制导致脾脏差异基因主要参与到与免疫、物质代谢及蛋白质加工等相关的通路及生物学过程。试验三TNFSF13B基因调节肉鸡免疫作用机制研究以UMNSAH/DF-1为细胞模型,通过构建TNFSF13B沉默siRNA载体,探索TNFSF13B调节肉鸡免疫的作用机制可能的分子基础。结果发现:沉默TNFSF13B基因极显著下调NF-κB(p≤0.001)和TGFβmRNA(p≤0.01)表达,同时免疫印迹试验发现NF-κBp65和NF-κBPp65蛋白表达量极显著下调(p≤0.001)。以上结果揭示了TNFSF13B调控NF-κB和TGF-β基因的表达以及激活NF-κB通路是其对机体免疫系统调节的分子水平的作用机制之一。结论:能量限制一定程度上降低了肉鸡的生长性能,但提高了肉鸡免疫器官指数、血清中免疫球蛋白的含量以及外周血中T-淋巴细胞的含量;同时还发现能量限制改善了脂类代谢。通过进一步对能量限制诱发的肉鸡脾脏差异表达基因的测序、筛选、鉴定等进行生物信息学综合分析,明确了能量限制导致脾脏差异基因主要参与到与免疫、物质代谢及蛋白质加工等相关的通路及生物学过程。通过沉默TNFSF13B基因发现,TNFSF13B调控NFκB和TGF-β基因的表达以及激活NFκB通路。
【学位单位】：河南农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S831.5
【部分图文】：

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称为 28 日龄对照组（E_C）。依此类推，获得 28 日龄试验 1 组(E_CR_1，能量限制 15%)、28 日龄试验 2 组（E_CR_2，能量限制 30%）、42 日龄对照组（L_C）、42 日龄试验 1 组（L_CR_1，能量限制 15%）和 42 日龄试验 2 组（L_CR_2，能量限制 30%）。样品检测合格后，构建 cDNA 文库。构建原理图如上图所示。文库构建完成后，使用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），检测合格的文库添加到 Illumina HiSeq 2000 测序平台上，所测序列为单端 100 bp，数据量 5G。4.1.8 测序数据评估与分析获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，去除接头和低质量序列得到 Clean reads。在参考鸡(Gallus gallus)的基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析。然后，使用 TopHat1.4.0 版本将 Clean reads 比对到鸡(Gallus gallus)的基因组上[150]。鸡基因组参见：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-72/fasta/gallus_gallus/dna。

电泳图,电泳图

L_CR_2 726 196 142.3 1.862 2.771 1.5 8.7A B C D E F M图4-2 总RNA电泳图（A ：E_C，B：E_CR_1，C：E_CR_2，D ：L_C，E：L_CR_1，F：L_CR_2， M：Marker）Figure 4-2Theelectrophoresis detections of total RNA（A ：E_C，B：E_CR_1

分析图,测序,分析图,基因

量的增加而增加，则说明测序还没有铺盖到要检测的大部分基因；反之，如果增加测序量而得到reads种类并未随之增加，则说明测序覆盖度已经检测大部分基因。本试验定量饱和曲线检查如图4-8所示。

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