猪瘟病毒复制与细胞自噬关系的研究

发布时间：2020-09-28 20:36

　　猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的猪的病毒性传染病,其典型症状与病理特征为高热、全身组织弥散性出血。猪瘟有较高的感染性和致死率,所以给我国养猪业带来严重的经济损失,也成为困扰养猪业的难题。猪瘟病毒为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。与其他瘟病毒属成员一样,CSFV在体内能快速增殖,并给宿主动物造成致死性伤害,但是体外细胞培养的猪瘟病毒,能在宿主细胞中持续感染并不产生细胞病变效应(CPE)。病毒作为一种严格的细胞内寄生生物,其复制增殖和培养特点很大程度取决于宿主细胞对病毒的抵抗以及病毒对细胞生理机制的逃避和调控。因此,探究病毒与细胞生理活动之间的关系,对于更清楚地了解病毒的致病机理有重要意义。细胞自噬(autophagy)是广泛存在于真核生物中维持细胞内环境稳态的一种生理现象。在真核细胞中,当细胞遭遇环境压力如饥饿、能量需求或者病原微生物侵袭时,细胞自噬会迅速发生。自噬通过溶酶体对细胞内的衰老细胞器、长寿命蛋白以及外源病原微生物进行吞噬和降解,其降解产物重新被细胞利用,用于重新合成蛋白质以维护细胞器功能及细胞内环境稳定等。此外,自噬还具有清除感染细胞内细菌和病毒的重要功能。但是近年来越来越多的报道表明,很多病毒并没有被细胞自噬机制抵制,反而利用自噬过程为病毒自身的复制增殖服务。这种看似违背常理的现象背后究竟隐藏着什么“秘密”,正是近年来人们研究的热点之一。为了探究CSFV在猪睾丸细胞系(swine testicles,ST)中与细胞自噬的关系,我们开展了研究工作,获得了以下结果:(1)CSFV对细胞自噬机制的影响。猪瘟病毒石门株(CSFV Shimen株)感染ST细胞后,通过透射电镜、MDC染色、LC3荧光观察,以及自噬相关基因蛋白表达水平的Western blot检测,结果发现,猪瘟病毒能诱导ST细胞自噬体双层膜结构的形成,并使GFP-LC3在细胞内形成聚点,上调自噬相关基因Beclin-1和LC3的表达,说明CSFV的感染能诱导细胞自噬的发生。CSFV感染后能显著促进自噬溶酶体底物蛋白p62的降解,但是氯喹(CQ)阻断自噬溶酶体形成后,CSFV的感染却显著上调了p62蛋白的表达。说明CSFV能诱导自噬溶酶体的形成,促进完整的自噬过程。紫外线灭活的病毒孵育后0.5 h能诱导自噬,但是后期却不能诱导自噬,说明病毒的吸附阶段能诱导自噬,然而持续自噬的诱导则需要病毒的复制过程。(2)CSFV蛋白对细胞自噬机制的影响。构建了CSFV的各个结构蛋白和非结构蛋白的真核表达载体,转染ST细胞后检测各蛋白对ST细胞自噬的影响,通过荧光定量PCR和Western blot检测自噬相关基因核酸和蛋白水平表达情况。结果发现,CSFV结构蛋白E1、非结构蛋白NS4B上调了自噬相关基因Beclin-1和LC3的表达,并促进了p62蛋白的降解。而非结构蛋白NS2和NS3上调Beclin-1和LC3的表达,却对p62蛋白的表达没有显著影响。说明E1、NS4B诱导了自噬的发生,并促进了完整的细胞自噬反应,NS2和NS3诱导了自噬的发生,但是并未诱导完整的自噬过程。(3)自噬对CSFV复制的影响。利用自噬促进剂Rapamycin,自噬抑制剂3MA,以及自噬流阻断剂CQ调控细胞自噬机制,从而研究细胞自噬对CSFV增殖的影响,结果发现,诱导自噬发生或者阻断自噬流均促进了CSFV的复制,而抑制自噬的发生则抑制了病毒复制,并且对自噬的调控在病毒感染之前对病毒的复制有显著的影响。进一步通过特异性干扰自噬基因,也证实抑制自噬过程不利于病毒复制。这就说明,自噬的发生,尤其是自噬体结构的形成能够促进病毒的增殖。(4)自噬在CSFV感染ST细胞中对细胞周期与增殖的影响。通过细胞增殖检测、流式细胞术、周期蛋白的定量分析以及DNA合成分析试验来检测自噬在CSFV感染中对细胞周期和增殖的影响,结果发现,CSFV感染ST细胞后,可引起S期细胞比例增加,细胞DNA合成增加,但是并未对细胞增殖产生明显影响。而在干扰掉自噬基因的细胞株中,CSFV的感染抑制了细胞增殖,细胞DNA合成受阻,细胞周期阻滞在G0/G1期。说明细胞自噬参与了病毒对细胞周期的调控。综上所述,本研究明确了CSFV感染可诱导ST细胞自噬,并促进完整的自噬过程;CSFV的E1蛋白和NS4B蛋白可诱导完整的自噬过程,NS2和NS3蛋白可诱导自噬的发生,但不能引起完整的自噬流;自噬过程有利于CSFV的复制;自噬参与了CSFV对细胞周期和增殖的调控。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.651
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章猪瘟病毒研究进展
        1.1 病原学研究概述
            1.1.1 CSFV结构以及生物学特性
            1.1.2 猪瘟病毒基因组结构及编码蛋白的生物学功能
        1.2 流行病学
            1.2.1 易感动物
            1.2.2 传播途径
            1.2.3 猪瘟病毒的进化分群
    第二章细胞自噬研究进展
        2.1 自噬的分类
            2.1.1 大分子自噬
            2.1.2 小分子自噬
            2.1.3 分子伴侣自噬
        2.2 细胞自噬研究方法
            2.2.1 自噬的静态检测
            2.2.2 自噬动态过程检测技术
        2.3 细胞自噬与病毒感染的相互作用
            2.3.1 病毒诱导细胞自噬的机制
            2.3.2 细胞自噬的抗病毒作用
            2.3.3 病毒利用细胞自噬促进自身增殖
            2.3.4 病毒抑制细胞自噬
            2.3.5 自噬与病毒相互抗衡
            2.3.6 病毒增殖与自噬无关
试验研究
    第三章猪瘟病毒感染ST细胞诱导自噬的发生
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、病毒与质粒
            3.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒
            3.1.3 主要仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 主要溶液配制
            3.2.2 细胞培养与猪瘟病毒的扩增及其感染复数的确定
            3.2.3 GFP-LC3B质粒的扩增与鉴定
            3.2.4 ST细胞接种猪瘟病毒与病毒增殖定量PCR检测
            3.2.5 透射电镜观察自噬体
            3.2.6 MDC染色观察自噬体
            3.2.7 GFP-LC3B转染细胞检测病毒对LC3 的影响
            3.2.8 Western blot检测自噬相关基因
            3.2.9 CSFV诱导细胞自噬流的检测
            3.2.10 灭活的病毒对细胞自噬的影响
        3.3 结果
            3.3.1 GFP-LC3B质粒的酶切鉴定
            3.3.2 猪瘟病毒在ST细胞中增殖检测
            3.3.3 MDC染色CSFV感染ST细胞
            3.3.4 透射电镜观察CSFV感染ST细胞后诱导自噬体结构形成
            3.3.5 CSFV感染ST细胞后诱导GFP-LC3 荧光聚点的形成
            3.3.6 CSFV感染ST细胞后引起自噬相关蛋白的变化
            3.3.7 CSFV感染ST细胞后诱导了完整的自噬反应
            3.3.8 紫外线灭活病毒后Western blot检测LC3 的转化
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章猪瘟病毒编码蛋白对细胞自噬的影响
        4.1 材料
            4.1.1 细胞与质粒
            4.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒
            4.1.3 主要仪器设备
        4.2 方法
            4.2.1 主要溶液配制
            4.2.2 真核表达载体转染ST细胞
            4.2.3 表达蛋白的鉴定
            4.2.4 CSFV蛋白对自噬相关基因转录水平的影响
            4.2.5 CSFV蛋白对自噬相关基因蛋白表达水平的影响
        4.3 结果
            4.3.1 真核表达载体转染ST细胞
            4.3.2 表达蛋白的鉴定
            4.3.3 CSFV蛋白对自噬相关基因转录水平的影响
            4.3.4 CSFV蛋白对自噬相关基因蛋白表达水平的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章细胞自噬对猪瘟病毒复制的影响
        5.1 材料
            5.1.1 细胞、病毒与质粒
            5.1.2 主要试剂、抗体及试剂盒
            5.1.3 主要仪器设备
        5.2 方法
            5.2.1 主要缓冲液及试剂配制
            5.2.2 CCK-8 试验检测药物对ST细胞的影响
            5.2.3 病毒感染与药物处理
            5.2.4 shRNA的转染与稳转筛选
            5.2.5 基因干扰效果的鉴定
            5.2.6 干扰自噬基因对猪瘟病毒复制的影响
        5.3 结果
            5.3.1 CCK-8 试验检测药物对ST细胞的影响
            5.3.2 自噬激活剂Rapamycin促进了病毒增殖
            5.3.3 自噬抑制剂 3MA降低了病毒增殖
            5.3.4 自噬流阻断剂CQ有利于病毒增殖
            5.3.5 不同加药方式对病毒增殖的影响
            5.3.6 自噬基因LC3、ATG7、Beclin-1 的干扰以及鉴定
            5.3.7 干扰自噬基因对CSFV增殖的影响
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章自噬参与CSFV对ST细胞周期和增殖的调控
        6.1 材料
            6.1.1 细胞、病毒与质粒
            6.1.2 主要试剂及试剂盒
            6.1.3 主要仪器设备
        6.2 方法
            6.2.1 主要缓冲液及试剂的配制
            6.2.2 干扰自噬基因细胞株的获得
            6.2.3 流式细胞术检测细胞周期
            6.2.4 CCK-8 检测细胞增殖
            6.2.5 BrdU染色检测细胞DNA
            6.2.6 定量PCR检测周期调节蛋白转录水平
        6.3 结果
            6.3.1 CSFV感染ST细胞对细胞周期的影响
            6.3.2 CSFV感染ST细胞对细胞增殖的影响
            6.3.3 CSFV对自噬基因缺陷细胞周期的影响
            6.3.4 CSFV对自噬基因缺陷细胞增殖的影响
        6.4 讨论
        6.5 小结
结论
本文的创新点
参考文献
缩略词
致谢
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