转录因子AP-2α对广西巴马小型猪GHR基因启动子的调控作用研究

发布时间：2020-09-28 22:00

　　我国具有独特和丰富的小型猪资源。其中广西巴马小型猪与人相比,其基因组同源性高达83%,在生理学、疾病发生机理、解剖学等方面与人类又相似,因此,小型猪是研究人体生理、病理机制和异种器官移植的理想实验动物模型[1]。广西巴马小型猪作为具有代表性的实验用小型猪之一,其具有体型矮小、性成熟较早、生长速度比大型瘦肉型猪种缓慢的特点。影响动物生长发育的因素较多且复杂,遗传、营养、环境以及激素等诸多因素对生长发育的调控都是通过神经内分泌生长轴(GH-GHR-IGFs)来实现的。有研究表明,广西巴马小型猪血清中GHR和IGF-I的浓度极显著低于杜洛克、约克夏和长白猪,但血清中GH浓度在4个品种之间没有显著差异。基因的转录是一个非常关键的阶段,它在遗传信息传递的过程中起着“桥梁”作用。转录的起始时间、起始位点和频率受到启动子这一重要元件的调控。启动子主要是通过与转录因子的结合来发挥调控作用的。为探索猪GHR基因启动子SNP位点与GHR表达的关系,本实验克隆了 2个广西地方猪种和3个国外猪种GHR基因启动子序列,筛选地方猪种与国外猪种差异SNP位点,研究差异SNP位点对GHR表达的影响,主要的研究结果如下:1.运用PCR扩增广西巴马小型猪(n=48)、陆川猪(n=28)、长白猪(n=42)、杜洛克猪(n=45)、大白猪(n=40)GHR基因启动子区约1300bp序列,测序后进行序列对比,结果发现GHR启动子上游区-758位点,广西巴马小型猪和陆川猪均为A,而长白猪、杜洛克猪和大白猪均为G。应用转录因子结合位点在线预测软件预测发现,该位点是AP-2α转录因子的结合位点。2.成功构建广西巴马小型猪GHR基因启动子核心区域-758位点突变型(-758 A→G)和野生型(-758 A)双荧光素酶报告基因载体,并转染PK15和C2C12细胞,结果发现,广西巴马小型猪突变型基因载体的启动子活性显著高于野生型载体的启动子活性(p0.05)。3.成功构建了转录因子AP-2α基因的超表达载体pcDNA3.1-AP-2α,转染PK15细胞后定量检测细胞中AP-2α和GHR基因的相对表达情况。结果显示,超表达AP-2α基因后,AP-2α基因的相对表达量显著上升(p0.01),GHR基因的相对表达量也显著上升(p0.01)。4.将广西巴马小型猪突变型(-758 A→G)和野生型(-758 A)GHR基因启动子双荧光素酶报告基因载体与转录因子超表达载体pcDNA3.1-AP-2α共转PK15细胞后发现,广西巴马小型猪GHR基因启动子突变型载体和pcDNA3.1-AP-2α共转组(实验组)的启动子活性显著高于广西巴马小型猪突变载体和pcDNA3.1共转组(对照组)(p0.05);广西巴马小型猪野生型载体和pcDNA3.1-AP-2α共转组(实验组)的启动子活性也显著高于广西巴马小型猪野生型载体和pcDNA3.1共转组(对照组)(p0.05)。AP-2α过表达上调突变型(-758A→G)启动子的活性的程度显著高于野生型(-758 A)(p0.01)。5.针对猪PK15肾细胞,设计了 5个shRNA载体用于内源性AP-2αα基因表达的干扰实验。shRNA载体转染PK15细胞后定量检测AP-2α基因和GHR基因的表达情况。结果显示,干扰AP-2α基因表达后,AP-2α基因的表达量显著下降(p0.01),GHR基因的表达量也显著下降(p0.01)。6.针对广西巴马小型猪GHR基因启动子中转录因子AP-2α结合位点的DNA碱基序列,设计了相应的生物素标记探针、冷竞争性探针和突变探针并进行EMSA实验。EMSA实验结果表明转录因子AP-2α能与所设计的探针相结合,证明转录因子AP-2α能够靶向GHR基因启动子上其相应的结合位点。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828
【部分图文】：

螺旋,二聚化,结构域,结合位点

所有成员在其Ｃ－末端都具有高度保守的螺旋－跨越－螺旋（ＨＳＨ）邋ＤＮＡ结合和二聚化结逡逑构域，并且在其Ｎ－末端具有较不保守的富含脯氨酸和富含谷氨酰胺的反式激活结构域＾逡逑（如图１－１所示）。大多数异构体在Ｎ－末端转录激活结构域中也具有ＰＹ基序（ＸＰＰＸＹ），逡逑这对于它们作为转录激活因子的作用是重要的［６气ＡＰ－２因子只有形成同源二聚体或异逡逑二聚体才有调控转录的活性。螺旋－跨越－螺旋基序与基本区域一起介导ＤＮＡ结合逡逑脯氨酸和谷氨酰胺酸区负责反式激活。在各种细胞和病毒增强子中，ＡＰ－２结合到回文逡逑共识序列Ｓｉ－ＧＣＣｌ＾ＧＧＣＧ’ＷＭ；在体外的结合位点选择实验揭示另外的结合序列逡逑５，－ＧＣＣＮ３ＧＧＣ－３，，５，－ＧＣＣＮ４ＧＧＣ－３＇和邋Ｓ＇－ＧＣＣＮＭＧＧＧｄ６３，６４］。与这些序列基序不同逡逑的其它结合位点，例如ＳＶ４０增强子元件５＇－ＣＣＣＣＡＧＧＣ－３＠５】，表明ＡＰ－２蛋白可能与逡逑一系列具有可变亲和力的富含Ｇ／Ｃ的元件结合。在其启动子序列中具有ＡＰ－２结合位点逡逑的靶基因参与诸如细胞生长和分化的生物过程，并且包括例如编码胰岛素样生长因子结逡逑合蛋白５邋（邋ＩＧＦＢＰ５邋）结合位点５＇－ＧＣＣＡＧＧＧＧＣ－３＿］，前胸腺激素ａ逡逑（５，－ＧＣＣＧＧＴＧＧＧＣ－３，）［６７］，雌激素受体（５，－ＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧ－３，）［６８］。逡逑７逡逑

示意图,定点突变,示意图,广西巴马小型猪

的广西巴马小型猪ＧＨＲ基因启动子序列为模板，利用Ｐｒｉｍｏｅｒ邋５．０和Ｏｉｉｇｏ７软件设计３逡逑对引物，对在启动子上面的转录因子ＡＰ－２ａ结合位点序列进行定点突变，引物序列详逡逑细信息如表２－１所示，定点突变流程图，如图２－１所示，引物由华大基因合成。逡逑１２逡逑

电泳图,电泳图,基因组,脂糖

２．３．１基因组ＤＮＡ的提取逡逑用紫外分光光度计检测猪基因组ＤＮＡ样品的浓度，将检测合格的样品进行１％琼逡逑脂糖凝胶电泳检测，如图２－１所示，泳道内的基因组ＤＮＡ样品条带明亮单一无杂带，逡逑可做为后续实验所需。逡逑图２－２猪基因组ＤＮＡ电泳图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｏｒｃｉｎｅ邋ｇｅｎｏｍｉｃ邋ＤＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ逡逑２４逡逑

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