鸡外周血淋巴细胞免疫应答REV感染的分子遗传机制研究
发布时间：2020-09-29 16:48
网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染导致的禽网状内皮组织增生症病(Reticuloendotheliosis,RE)是家禽业三大病毒肿瘤疾病之一,我国肉鸡的REV感染率已达20%-30%,迄今为止尚无有效的防治措施,主要原因是对REV感染的致病和免疫调控机理缺乏深入研究。目前,对REV感染脾脏组织和成纤维细胞开展了一定的探索,但淋巴细胞这一主要免疫细胞在鸡感染REV过程中的免疫调控机理尚不清楚。本实验通过制备鸡活体和体外淋巴细胞REV感染模型,从REV感染后淋巴细胞中差异基因表达、信号通路介导、关键基因表达调控等方面展开系列研究,以期阐明鸡感染REV后淋巴细胞的免疫调控机理及其分子调控网络,为我国鸡群网状内皮组织增生症病防治和抗病育种等工作提供理论依据和发展思路,促进肉鸡产业发展和提高经济效益。本文主要研究结果如下:1.鸡REV感染模型的建立鸡活体和外周血淋巴细胞的REV感染模型是本实验工作的基础,其有效性是本实验的关键所在。分别选择200只1日龄的无母源抗体的SPF鸡和外周血淋巴细胞用于建立REV感染模型。REV体内感染1周或体外感染36 h后,体内、外淋巴细胞中均检测到较高水平的REV基因组长末端重复序列LTR表达,而对照组中均未扩增到LTR。鸡活体感染REV后第1-5周的肝脏和脾脏解剖病变表明,病毒接种后第2-4周,感染组的肝脏和脾脏较之对照组明显肿大,具备了 REV感染的病理学特征;脾脏免疫指数随着发育先升高后降低,而胸腺和法氏囊免疫指数随着发育逐渐降低。相比对照组,REV感染组从第2周和第3周脾脏免疫指数显著升高,胸腺和法氏囊免疫指数均明显降低(P0.05或P0.01);鸡活体REV感染第2周与体外淋巴细胞REV感染60 h后进行MTT检测,体内、外REV感染组的淋巴细胞数量均显著低于对照组(P0.05或P0.01),IL-8和IL-18表达水平在体内、外感染组中均显著低于对照组(P0.05或P0.01);而IFN-γ、TNFα和IL-2水平则无显著差异。以上结果表明体内、外REV感染模型建立成功。同时,选择体内REV感染后第2周的样本用于后继验证试验。2.鸡外周血淋巴细胞体外感染REV后的免疫调控机理分析为了排除体内REV感染的诸多干扰因素,本章试验基于已经建立的体外REV感染淋巴细胞模型,利用RNA-seq技术,从REV感染后基因表达改变、信号通路介导等角度深入系统地解析REV感染后淋巴细胞的免疫调控机理。以|log2(Fold change)|≥2.0,padj0.05为筛选标准,RNA-seq共筛选到2977个差异表达基因(Differential expression genes,DEGs),包括996个上调基因和1981个下调基因;基于2977个DEGs的聚类分析显示,REV感染组和对照组完全被分开,且组内3个重复被聚集在一起。qRT-PCR验证部分DEGs结果表明:RNA-seq和qRT-PCR两种方法得到的结果具有一致性,具有高度的正相关性(r=0.9014,P0.01),支持了 RNA-seq数据的准确性。GO 聚类分析发现 Inflammatory response、Defence response to bacterium 和 Cell proliferation等被显著富集,KEGGPathway分析发现MAPK-AP1、免疫应答相关通路(Toll-likereceptor,NOD-likereceptor 和 salmonellainfection)、细胞增殖/凋亡相关通路(FOXO 和p53)等信号通路被显著富集。根据显著富集的GO-terms和KEGG pathway,筛选到与免疫相关的DEGs 130个、与细胞周期相关的DEGs 56个、与脂肪代谢相关的DEGs 55个。其中,富集于免疫相关信号通路的IL8L1、IL18、TRR2A、TLR4、TLR7、TRAF3、TRAFF5和TRAF6等基因在REV感染淋巴细胞后表达量显著下调,而CD40、CD80、NOD1和MYD88基因则显著上调,推断这些基因可能是REV体外感染淋巴细胞后调控免疫反应的关键基因;发现 Toll-like receptor、NOD-like receptor 和 salmonella infection 三条信号通路同时汇集于MAPK-AP1通路,进而下调免疫因子IL-8和IL-18的表达水平。细胞增殖相关CCNB2、CCNB3、CCND1、CCND2、CCND3、CCNG2、CDKN1B、GADD45A等DEGs显著富集于FOXO信号通路,而GADD45A、CCNB2、CCNB3、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2和CDK6等显著富集在p53信号通路中。qRT-PCR验证结果显示,SMAD3、FOXO1、FOX03、FOXO4、CCND1、CCND2、CCNE2、CDKN1B等基因的表达水平均显著下调(P0.05)。然而,TGFB、TGFBR2、IL10、CCNG1、GADD45A、CCNA2、CCNB2、CCND3和的表达水平却显著上调(P0.05);推断上述基因可能是REV体外感染淋巴细胞后调控细胞增殖的关键候选基因。REV感染鸡外周血淋巴细胞后,通过抑制FOXO和p53信号通路来下调细胞周期相关基因表达,从而抑制淋巴细胞的增殖。此外,还筛选到了 55个与脂肪代谢相关的DEGs。其中,脂肪酸代谢与脂肪合成相关的基因ACSL3、ACSL6、DGAT2等在REV感染淋巴细胞中的表达量显著低于对照组细胞(P0.01),而脂肪分解和脂肪酸转运相关的基因PPARG、FABP3、FABP4、LPL、PLIN2的表达量则显著高于对照组细胞(P0.01),提示了 REV感染后,鸡淋巴细胞利用外源脂肪酸的能力增强,提示可能外源脂肪酸是REV感染致病或免疫调控过程的主要能量来源。3.MAPK-AP1通路介导鸡免疫应答REV感染作用的验证根据第二章体外淋巴细胞REV感染模型的结果,在活体和细胞水平验证了 MAPK-AP1在REV感染外周血淋巴细胞中的作用。首先,检测了体内、外REV感染模型中AP-1水平以及ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化活性变化,发现体内、外模型淋巴细胞中AP-1水平、JNK和p38MAPK的磷酸化活性均明显降低,而ERK1/2的磷酸化水平无明显变化,提示JNK和p38MAPK信号通路均通过AP1蛋白参与了 REV感染后外周血淋巴细胞的免疫调控。进一步地,单独抑制淋巴细胞中JNK或p38MAPK的磷酸化活性后,AP1蛋白水平均明显下调,淋巴细胞的数目明显减少,并且免疫因子IL-8和IL-18分泌水平显著地降低;相反地,单独激活REV体外感染的淋巴细胞中JNK或p38MAPK的磷酸化活性,AP1蛋白水平均明显上调,淋巴细胞的数目和免疫因子IL-8、IL-18的分泌水平显著地升高;JNK和p38MAPK被同时抑制或激活后,淋巴细胞的数目和免疫因子IL-8和IL-18的分泌水平均显著高于单独处理组。此外,正常外周血淋巴细胞中AP1蛋白水平被特异性抑制剂处理后,淋巴细胞的数目和免疫因子IL-8、IL-18的分泌水平亦会显著地降低。以上证实了JNK/p38MAPK-AP1信号通路通过调控淋巴细胞的增殖和免疫因子IL-8和IL-18的分泌,参与REV感染后鸡外周血淋巴细胞的免疫应答调控过程。最后,体外抑制AP1活性之后的细胞数目和免疫因子(IL-8和IL-18)分泌水平具有显著的正向相关性,提示了 REV感染外周血淋巴细胞中免疫因子(IL-8和IL-18)分泌的降低与胞内相关基因活性和淋巴细胞数目减少相关。4.LncRNA对淋巴细胞应答REV感染的关键基因及其通路的表达调控LncRNA作为miRNA、piRNA、内源性siRNA等小分子RNA的前体分子,可以通过表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等方式改变靶基因的表达。因此,本章探究了LncRNA对所筛选的关键基因表达的调控作用,进一步完善REV感染鸡外周血淋巴细胞的免疫调控机理。基于RNA-seq数据,筛选到134个差异表达LncRNA。综合显著富集的免疫相关信号通路和差异表达mRNAs进行LncRNA靶基因预测分析,发现有2个新的LncRNAs(L11530和L09863)可能分别调控NOD-like receptor信号通路中NOD1和TRAF5基因表达。基因结构分析表明,这2个候选LncRNAs通过顺式调控的方式调控相应靶基因的表达。qRT-PCR检测结果显示,REV体外感染外周血淋巴细胞中L11530及其靶基因NOD1表达水平显著上调(P0.05,P0.01),而L09863及其靶基因TRAF5表达水平显著下调(P0.05,P0.01);相同的表达变化规律也发生在体内REV感染鸡的外周血淋巴细胞中。相反地,L11530被干扰后则相应的靶基因表达具有相反的变化。以上结果提示了新筛选到的LncRNAs(L11530和L09863)可能分别通过靶向调控鸡外周血淋巴细胞中NOD1或TRAF5的表达而参与REV感染鸡的免疫调控。综合上述内容,本研究从REV感染后基因表达改变、信号通路介导和关键基因表达调控等角度解析了 REV感染后的鸡外周血淋巴细胞免疫应答的分子调控机理。发现REV感染鸡后,外周血淋巴细胞通过抑制FOXO和p53信号通路而减少细胞增殖,同时通过抑制MAPK(JNK/p38MAPK)-AP1信号通路减少免疫因子IL-8和IL-18分泌,达到免疫调控的效应。另外,发现REV感染鸡外周血淋巴细胞后胞内外源脂肪代谢活动旺盛,可能在REV感染致病和免疫应答中发挥重要的作用。在此免疫调控过程中,表达下调基因IL8L1、IL18、TLR2A、TLR4、TLR7、TRAF3、TRAF5、TRAF6和上调基因CD40、CD80、NOD1、MYD88等是REV感染后淋巴细胞中免疫调控的关键基因,LncRNA通过靶向调控NOD和TRAF5的表达而参与REV感染鸡的免疫调控;此外,下调表达基因SMAD3、FOXO1、FOXO3、FOXO4、CCND1、CCND2、CCNE2、CDKN1B 等和上调表达基 因 TGFB、TGFBR2、IL10、CCNG1、GADD45A、CCNA2、CCNB2、CCND3、CDK6等则是调控淋巴细胞增殖的关键基因。以上述结果为基础构建了REV感染的分子调控网络,为揭示鸡外周血淋巴细胞对REV免疫应答的潜在分子机理提供新的线索。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：
生存过程中的长期环境压力进化出了抵御外界大多数病菌危害的疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子。其中，中枢免疫器腺，而外周免疫器官则包括脾脏、盲肠和扁桃体等（见图Ｍ邋）。对腺和脾脏三者在体液免疫及细胞免疫中起着举足轻重的作用。逡逑
３．１鸡体内、外ＲＥＶ感染模型的建立逡逑在ＲＥＶ感染肉鸡１周后，采集外周血以分离淋巴细胞，并提取ＤＮＡ；另外，在ＲＥＶ逡逑体外感染淋巴细胞３６邋ｈ后，收集培养的淋巴细胞并提取ＤＮＡ。通过ＰＣＲ检测，如图２－１逡逑所发现，扩增的特异性ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，其片段大小符合预期；扩增产逡逑物测序结果确认为鸡的ＬＴＲ目标片段。逡逑经过ＲＥＶ感染后的鸡外周血淋巴细胞中ＲＥＶ（ＧｅｎＢａｎｋＳ７０３９８）长末端重复序列ＬＴＲ逡逑的目标片段ＬＴＲ被扩增到，并且具有较高的水平；体外感染的淋巴细胞中，同样，ＲＥＶ逡逑（ＧｅｎＢａｎｋ邋Ｓ７０３９８）长末端重复序列ＬＴＲ的目标片段ＬＴＲ被扩X椀剑簿哂薪细叩乃健ｅ义系牵歉髯缘亩哉兆橹芯蠢┰龅剑蹋裕摇ｅ义霞钐甯腥荆遥牛趾螅诘冢薄ⅲ病ⅲ场ⅲ础ⅲ抵芊直鹜涝祝始烊「卧嗪推⒃啵鄄炱湫五义咸浠＝峁砻鳎遥牛指腥咀楹投哉兆榈母卧嗪推⒃嘧橹孀湃樟涞脑黾佣⒂浯蟆ｅ义系牵痈腥竞蟮冢玻粗埽现锤腥荆遥牛值亩哉兆椋腥咀榈母卧嗪推⒃嗫济飨灾族义洗
本文编号：2829993
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：
生存过程中的长期环境压力进化出了抵御外界大多数病菌危害的疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子。其中，中枢免疫器腺，而外周免疫器官则包括脾脏、盲肠和扁桃体等（见图Ｍ邋）。对腺和脾脏三者在体液免疫及细胞免疫中起着举足轻重的作用。逡逑
３．１鸡体内、外ＲＥＶ感染模型的建立逡逑在ＲＥＶ感染肉鸡１周后，采集外周血以分离淋巴细胞，并提取ＤＮＡ；另外，在ＲＥＶ逡逑体外感染淋巴细胞３６邋ｈ后，收集培养的淋巴细胞并提取ＤＮＡ。通过ＰＣＲ检测，如图２－１逡逑所发现，扩增的特异性ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，其片段大小符合预期；扩增产逡逑物测序结果确认为鸡的ＬＴＲ目标片段。逡逑经过ＲＥＶ感染后的鸡外周血淋巴细胞中ＲＥＶ（ＧｅｎＢａｎｋＳ７０３９８）长末端重复序列ＬＴＲ逡逑的目标片段ＬＴＲ被扩增到，并且具有较高的水平；体外感染的淋巴细胞中，同样，ＲＥＶ逡逑（ＧｅｎＢａｎｋ邋Ｓ７０３９８）长末端重复序列ＬＴＲ的目标片段ＬＴＲ被扩X椀剑簿哂薪细叩乃健ｅ义系牵歉髯缘亩哉兆橹芯蠢┰龅剑蹋裕摇ｅ义霞钐甯腥荆遥牛趾螅诘冢薄ⅲ病ⅲ场ⅲ础ⅲ抵芊直鹜涝祝始烊「卧嗪推⒃啵鄄炱湫五义咸浠＝峁砻鳎遥牛指腥咀楹投哉兆榈母卧嗪推⒃嘧橹孀湃樟涞脑黾佣⒂浯蟆ｅ义系牵痈腥竞蟮冢玻粗埽现锤腥荆遥牛值亩哉兆椋腥咀榈母卧嗪推⒃嗫济飨灾族义洗
本文编号：2829993
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