蓝舌病病毒和鹿流行性出血热病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2020-10-01 18:53

　　 为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。
【部分图文】：

├磁卸ǜ梅椒ǖ闹?复性。1.11双重荧光定量RT-PCR的应用收集经过实验室验证的40份阳性样品（20份BTV阳性、10份EHDV阳性、10份BTV与EHDV混合感染样品），其他临床组织样品40份，共计80份，采用建立的双重荧光定量RT-PCR进行检测，以验证该方法的准确性。2结果2.1标准曲线的绘制以浓度为1×102～1×107copies/L的混合质粒标准品作为模板，根据已优化的条件进行双重荧光定量RT-PCR。生成的标准曲线显示，BTV和EHDV的相关系数R2分别为0.990和0.982，表明起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系（见图1）。2.2特异性试验分别对BTV、EHDV、FMDV、VSV、SBV、PPRV、GTPV和SPPV病毒样品提取RNA，利用建立的双重荧光定量RT-PCR方法进行检测。结果显示，BTV和EHDV在各自的检测通道均有特异性扩增，而其他病毒则无明显扩增曲线（见图2），说明该方法具有较好的特异性。3530252015101086420拷贝数（lg）CopynumberEHDVBTV图1双重荧光定量RT-PCR标准曲线Fig.1Standardcurvesoftheduplexreal-timeRT-PCR图2双重荧光定量RT-PCR特异性试验的扩增曲线Fig.2Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforspecificitydetection400350300250200150100500-50-100-150循环数Cyclenumber0510152025303540123-9-1.8529.68相对荧光强度Relativeluorescenceunits（RFU）热循环数Thresholdcycle1126

，以验证该方法的准确性。2结果2.1标准曲线的绘制以浓度为1×102～1×107copies/L的混合质粒标准品作为模板，根据已优化的条件进行双重荧光定量RT-PCR。生成的标准曲线显示，BTV和EHDV的相关系数R2分别为0.990和0.982，表明起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系（见图1）。2.2特异性试验分别对BTV、EHDV、FMDV、VSV、SBV、PPRV、GTPV和SPPV病毒样品提取RNA，利用建立的双重荧光定量RT-PCR方法进行检测。结果显示，BTV和EHDV在各自的检测通道均有特异性扩增，而其他病毒则无明显扩增曲线（见图2），说明该方法具有较好的特异性。3530252015101086420拷贝数（lg）CopynumberEHDVBTV图1双重荧光定量RT-PCR标准曲线Fig.1Standardcurvesoftheduplexreal-timeRT-PCR图2双重荧光定量RT-PCR特异性试验的扩增曲线Fig.2Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforspecificitydetection400350300250200150100500-50-100-150循环数Cyclenumber0510152025303540123-9-1.8529.68相对荧光强度Relativeluorescenceunits（RFU）热循环数Thresholdcycle1126

ityassayofthedulplexreal-timeRT-PCR病毒Virus标准品浓度/（copies·L-1）组内试验Intra-assay组间试验Inter-assayConcentrationofstandard平均值X±SD变异系数/％CV平均值X±SD变异系数/％CVEHDV1×10332.83±0.180.5432.78±0.391.201×10427.47±0.381.3927.79±0.301.091×10524.89±0.110.4525.48±0.321.27BTV1×10328.47±0.421.4628.18±0.401.431×10425.38±0.160.6224.94±0.642.551×10523.51±0.130.5523.10±0.562.40图3双重荧光定量RT-PCR敏感性试验的扩增曲线Fig.3Dynamiccurvesoftheduplexreal-timeRT-PCRforsensitivitydetectionA：EHDV的扩增曲线；B：BTV的扩增曲线；1～6：质粒浓度分别为1×107～1×102copies/L；7：阴性A：EHDVamplification；B：BTVamplification；1—6：Plasmidconcentrationof1×107—1×102copies/L；7：Negative2.3敏感性试验以浓度为1×101～1×107copies/L的混合质粒标准品作为模板，根据已优化的条件进行双重荧光定量RT-PCR。结果显示，1×101copies/L未被检测到荧光信号，其他浓度的标准品均呈阳性，说明BTV和EHDV的检出下限均为1×102copies/L（见图3）。2.4重复性试验取3个浓度的混合质粒标准品对该方法进行重复性检验，结果显示，不同浓度标准品的组内Ct值变异系数（CV）在0.54％～1.46％之间，组间Ct值CV在1.09％～2.55％之间（见表2），说明该方法具有较好的重复性。2.5临床样品的检测用建立的方法对80份已知临床样品进行检测，结果，40份阳性样品的检验结果均为阳性：20份BTV阳性，10份EHDV阳性，10份混合感染阳性，检出率为100％；其他40份样品?

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