捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药相关基因筛选及其分子调控机制初探

发布时间：2020-10-02 10:46

　　捻转血矛线虫是反刍动物主要的消化道线虫之一,给养殖业造成了巨大的经济损失。由于长期的药物驱虫,捻转血矛线虫在很多地区已经出现了针对丙硫咪唑等常用驱虫药的耐药性,成为制约寄生虫病防治的重要因素。到目前为止,在寄生虫耐药性产生机理方面尚未完全清晰。本研究对内蒙古乌审旗和察右后旗绵羊捻转血矛线虫病进行流行病学调查及耐药性检测;利用比较转录组学技术对捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药株给药前、给药后及敏感株、耐药株开展相关研究,对可能的耐药基因进行功能、代谢通路及可能的耐药机制分析,并筛选出3个耐药相关基因,对其进行重组表达。为深入探索捻转血矛线虫耐药机制、筛选对耐药性检测的分子标记及耐药性早期鉴别诊断方法的建立提供重要数据。研究结果如下:(1)乌审旗和察右后旗绵羊捻转血矛线虫平均感染率分别为89%和78%,虫卵减少率分别为9.80%和20.4%,这2个地区的捻转血矛线虫对丙硫咪唑产生耐药性。(2)捻转血矛线虫耐药株给药前和给药后比较转录组学分析,共获得851个差异表达基因,显著富集到ATP结合、代谢过程、蛋白水解等功能分类中,主要参与核糖体合成、细胞凋亡、过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)等通路。(3)捻转血矛线虫敏感株和耐药株比较转录组学分析,共获得显著差异表达基因913个,主要参与谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对异种生物的代谢、药物代谢细胞色素P450等。(4)对3个耐药基因进行克隆及生物信息学分析,成功构建了 BL21(pETGST)、BL21(pETP450)和 BL21(pETABC)三个重组表达系统,并通过Ni+获得了纯度较高的重组蛋白。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.27
【部分图文】：

示意图,捻转血矛线虫,生活史,示意图

Ｆｉｇ．邋１邋Ｌｉｆｅ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ邋ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ逡逑矛线虫的流行逡逑线虫在我国流行较广泛，额叶勒德格等（２０１８）通过化道线虫感染情况进行流行病学调查，结果显示，该十分普遍，感染率达到８４．３％％孔令杰（２０１５）通虫流行病学调查，发现该地区捻转血矛线虫感染率较（２０１８）通过对湖北省部分地区山羊重要寄生蠕虫转血矛线虫感染率最高，且为优势虫种［９］。由于该病流行病学调查中捻转血矛线虫感染情况有明显差异性，原因的说法不一［１０］。春季万物复苏，温度适宜，感染宿主进食时经口感染，导致该病的爆发；捻转血矛线的重要原因之一，大量的虫体在宿主体内停滞发育，°Ｃ死亡，待春季时期，大量的滞育期虫体发育为成虫，致“春潮”现象［｜１］。逡逑

示意图,耐药机制,微管蛋白,丙硫咪唑

质内游离态微管蛋白的主要形式，同时也是微管组装的基本单位，在机体的正常逡逑活动中起到重要的作用，如参与细胞内物质运输、维持细胞形态及辅助完成染色逡逑体运动等丙硫咪唑可以在寄生虫微管蛋白聚合之前与微管蛋白结合（见图２），逡逑阻止微管蛋白组装，引起蛋白代谢障碍，从而终止细胞周期，导致虫体死亡［４７１。逡逑研究发现，捻转血矛线虫对丙硫咪唑耐药性与Ｐ－微管蛋白同种Ｉ型基因的单逡逑核苷酸多态性有关。Ｋｗａ邋（１９９４）等ｗ在研究捻转血矛线虫耐药株时，首次发现逡逑了Ｐ－微管蛋白同种Ｉ型基因的单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，逡逑ＳＮＰ），由苯丙氨酸变成酪氨酸，即Ｆ２００Ｙ邋（ＴＴＣ至ＴＡＣ）。Ｄｒｏｇｅｍｕｌｌｅｒ邋（２００４）逡逑等［４９１发现了耐药株Ｐ－微管蛋白同种Ｉ型基因在丨６７位点的ＳＮＰ，即Ｆ１６７Ｙ邋（ＴＴＣ至逡逑ＴＡＣ）。Ｇｈｉｓｉ邋（２００７）等网报道了耐药虫株Ｐ－微管蛋白同种Ｉ型基因在１９８位点的逡逑ＳＮＰ，即Ｅ１９８Ａ邋（ＧＡＡ至ＧＣＡ）。Ｆ２００Ｙ是丙硫咪唑产生耐药性的主要因素，呈逡逑全球性分布

序列,实验流程,转录组,测序技术

在ｃＤＮＡ两端加上测序接头，利用高通量测序仪进行测序，直至获得逡逑足够的序列，所得序列比对到参考基因组（有参转录组）或进行从头组装（ｄｅ邋ｎｏｖｏ逡逑ａｓｓｅｍｂｌｙ邋（无参转录组）形成全基因组范围内的转录谱（见图３）。所谓有参转录逡逑组是指在有参考基因组的分析中，基于己知物种的基因组信息，把测序得到的逡逑ｒｅａｄｓ比对到参考基因组上，然后计算出己知注释基因的表达量，或对感兴趣的逡逑一类基因在不同组织或不同状态下的表达量进行研宄。另外，通过转录组测序可逡逑以发现一些新的转录本，鉴定新的基因和新的ＩｎｃＲＮＡ，也可以通过与参考基因逡逑组进行比对，进而发现ＳＮＰ位点及可变剪切位点［７３】。逡逑ＲＮＡ片段化处砰逡逑｜邋反转求介成ｃＤＮＡ文片逡逑｜邋ＤＮ邋Ａ＇阐序接头连接逡逑、逦＇公}、…逡逑Ｉ邋Ｋ’Ｒ扩增文库逡逑Ｔ逦？？逦逡逑－＇ｍｕｍ逡逑＇、、逦＇邋＾ｍａｍ逡逑｜深度Ｍ序逡逑ｍｍｍ逡逑ＷＵＫＢＳＵＳ邋９ＷＭＳＫＫ＆Ｓ９邋９ＨＲＳ８Ｍ＾ｔ邋８８Ｍｍｍ逡逑ＫＮＡＲ？列信总逡逑图３邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ实验流程［７４］逡逑Ｆｉｇ．３邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ逡逑随着测序技术在生命科学领域的发展，传统的Ｓａｎｇｅｒ法测序远远不能满足新逡逑型分子生物学技术对测序技术的的需要，越来越多的功能和表型之间的内在联系逡逑有待通过“组学”测序技术去揭示。与此同时

【参考文献】