猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究

发布时间：2020-10-09 00:46

　　猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)作为一种猪病毒性传染病,其病原为PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)。目前PRRS在全世界的猪场广泛流行传播,造成了巨大的经济损失。2006年,我国突然爆发了猪高热病,其临床症状主要为持续高热,迅速死亡,传染性非常强,发病率接近100%,同时引起妊娠母猪严重流产等繁殖障碍,对我国养猪业产生了巨大危害,该病病原随后被鉴定为高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV),该毒株是一种变异的PRRSV毒株。对于PRRSV的防控与净化目前还没有很好的方法,鉴于天然免疫在抗病毒过程中起着重要作用,因此需要进一步阐明其免疫机制,从而为该病的有效防控奠定基础。病毒感染宿主后,机体的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)会迅速识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信号通路从而诱导干扰素(interferon,IFN),以及下游干扰素诱导基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的大量产生,进而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性,之前的研究主要围绕在PRRSV蛋白对固有免疫的抑制效应及其机制,关于PRRSV如何被机体识别,以及诱导IFN产生的机制研究较少。本论文针对此问题进行了研究,取得的主要结果如下:1、本研究首先采用RNA结合蛋白免疫沉淀及测序(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation sequence,RIP-seq)等实验方法分析了PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)过程中,PRRSV基因组被黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和视黄酸诱导基因I(RIG-I)识别的碱基序列,结果表明在PRRSV感染的PAM中,RIG-I和MDA5主要结合于PRRSV正链基因组的3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’UTR),同时RIG-I和MDA5的结合有U/C和U/G碱基序列特异性。2、PRRSV属于套式病毒目,其基因组和亚基因组都含有共同的5’和3’UTR区域,对病毒的复制至关重要,同时本研究前期RIP-seq结果已证明,PRRSV 3’UTR区域对于免疫识别非常重要,因此我们进一步研究了PRRSV基因组5’和3’UTR与免疫识别之间的关系。结果表明,PRRSV基因组的5’和3’UTR能够刺激细胞产生IFN,并且位于PRRSV基因组3’UTR的假结结构能够作为一种新的PAMP被模式识别受体RIG-I和Toll样受体3(Toll like receptor 3,TLR3)识别,从而强烈地诱导IFN及ISGs的产生。由于假结结构是RNA病毒末端两个茎环相互作用形成的三级结构,能作为分子开关调节病毒RNA合成以及病毒复制,本研究发现此假结结构还能作为PAMP诱导抗病毒免疫应答,且将此假结结构相互作用破坏后其诱导IFN的能力显著降低。RNA-pull-down结果显示,RIG-I的调节区(regulation domain,RD)和TLR3的腔内区(ectodomain,ECD)均能与PRRSV基因组3’UTR的假结结构RNA结合。在PAM中转染此假结结构能显著抑制PRRSV复制,表明该结构具有抗病毒能力。序列比对及二级结构预测显示,动脉炎病毒科其它成员在基因组3’UTR都含有假结结构,此结构在动脉炎病毒科中非常保守,且这些病毒基因组的假结结构都能有效诱导IFN产生。3、对猪源RIG-I的RD区(pRIG-I-RD)进行了表达和纯化,并采用凝胶过滤层析验证了pRIG-I-RD和PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA的相互作用。同时本实验采用小角散射(Small-angle X ray scattering,SAXS)技术分析了PRRSV 3’UTR假结结构RNA与pRIG-I-RD复合物在溶液中的状态,结果显示其为细长的大分子结构,可能含有多个区域,至少有两个中心。由于PRRSV基因组的5’末端带有帽子,其识别机制与之前报道的机制不同,因此本研究为深入研究RIG-I识别模式奠定了基础。综上所述,本研究鉴定了3’UTR的假结结构可以作为病原相关分子模式特异性激活RIG-I和TLR3介导抗病毒免疫应答,并且该模式在动脉炎病毒科中非常保守。结合以往研究,我们提出了一个PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN效应与PRRSV蛋白抑制IFN效应平衡的模型。在早期胞内体中,病毒基因组释放到细胞质内,基因组mRNA可以作为模板翻译复制转录酶蛋白(polyprotein precursors 1 a,pp1a)(polyprotein precursors 1 ab,pp1ab),经过切割后这些蛋白组装成复制转录复合体(replication and transcription complex,RTC),然后结合到PRRSV 3’UTR区域起始负链RNA合成。在PRRSV复制过程中,PRRSV基因组3’UTR假结结构能够被模式识别受体RIG-I的RD区和TLR3的ECD区识别并激活核转录因子κB(NF-κB)或干扰素调节因子3(IRF3)产生IFN。病毒的蛋白例如非结构蛋白1/2/4/11(nonstructural proteins 1/2/4/11,NSP1/2/4/11)和结构蛋白N蛋白可以通过靶向IRF3或NF-κB从而干扰宿主的抗病毒应答。因此,PRRSV基因组3’UTR假结结构既能作为分子开关调节病毒RNA合成,同时可以影响天然免疫识别以及下游IFN产生。本研究为探索PRRSV免疫识别机制及发现RIG-I和MDA5新的识别特征奠定了重要研究基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

形态图,电子显微镜,形态,颗粒

图 1-1 PRRSV 颗粒在电子显微镜下的形态（引自 (Dokland et al., 2010)）1-1 Electron microscopy description of PRRSV virions (cited from (Dokland et al., 1-2 所示，在 PRRSV 复制和翻译过程中，由 ORF2-7 基因组序列产生，所有的亚基因组 RNA 含有共同的 3’ UTR 区域，同时其 5’端含有源于 PRRSV 基因组的 5’ UTR 部分区域，且该区域含有重要的转录共同 5’端和 3’端的亚基因组 RNA 是由病毒的非连续型复制方et al. 2007)，其编码 PRRSV 的结构蛋白 GP2/3/4/5、M 蛋白和 N 蛋白 RNA 的过程中首先要以 PRRSV 基因组为模板合成负链亚基因组 Ric RNA，（-）sgRNA），在负链亚基因组 RNA 的 3’末端区域含有一NA 上的 TRS 互补的反向前导序列，在产生亚基因组过程中，此序列续移动与正链基因组的 TRS 序列互补，从而形成不同的负链亚基t al. 2013)。SV 基因组 RNA 3’ UTR 末端发卡结构是病毒 RNA 合成所必需的，并环状区域相互作用形成假结结构 (Beerens et al. 2007b)，此假结结构毒中非常保守，作为分子开关调节负链 RNA 合成。此外，PRRSV

示意图,主要结构,基因组,亚基因组

第一章文献综述聚复制聚合酶蛋白前体 (Meulenberg et al. 1993)。这两个多聚复制聚合酶蛋白前体特定的蛋白酶裂解从而产生至少 14 个具有不同结构和功能的 NSPs。由 ORF1a 开读框编码的非结构蛋白主要包括 6 个蛋白即 NSP1α/1β/2/3/4/5，而由 ORF1b 开放阅编码的非结构蛋白主要包括 4 个蛋白即 NSP9-12。将 pp1a 和 pp1ab 进行加工的蛋主要位于NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4上 (Dea et al. 2000; Snijder et al. 1998)。PRRTC 的形成依赖于这些非结构蛋白的正确翻译及组装，组装成功的 RTC 围绕在内质近，进一步进行基因组的复制和病毒颗粒的组装，包括亚基因组的合成及翻译，产条编码不同结构蛋白的亚基因组，在亚基因组的序列两端存在共同的非编码区 5’和度分别为 190-220 nt 和 150 nt，其对亚基因组的翻译过程至关重要，亚基因组进一成病毒颗粒组装所需的结构蛋白 (de Vries et al. 1990; Kroese et al. 2008)。

蛋白,病毒,抗病毒免疫,宿主免疫

图 1-4 PRRSV 膜蛋白相互作用（引自 (Das et a1．，2010)）he PRRSV envelope protein complex of PRRSV (cited from (Das et a1颗粒的组装，目前认为最主要的蛋白是 GP5、M 和 N 蛋白使病毒正确组装。有研究报道 GP2a/3/4 和 E 蛋白是病毒感毒形成的重要蛋白，但是也会参与病毒组装，这四个蛋白在，表达在病毒表面，缺一不可。另外这个多元复合物中糖蛋体 CD163 相互作用，对于病毒入侵至关重要 (Das et al. 20蛋白，GP5 和 M 蛋白作为外源物质对于宿主免疫反应有强亚单位疫苗的开发 (Pirzadeh et al. 1998)。同时，研究发现联表达后，其对于宿主细胞的免疫刺激效应显著增强，GP白但是其可以与 GP5 协同作用从而增强机体的抗病毒免疫预防和控制临床上引起严重的经济损失，因此自此病出现以来，关于止过，常规的疫苗类型分为将 PRRSV 灭活的灭活疫苗和将

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