瑞香素对急性肾损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-10-11 05:06

　　 急性肾损伤(AKI)是由多种病因引起的高致死率的临床综合征,也是临床常见的急危重症之一,其医疗费用高昂,且目前尚缺乏有效的预防和治疗措施。正是由于上述原因AKI已经受到广泛的关注,并成为全世界需要共同面对与亟待解决的公众健康问题。大量文献报道,药物性肾损伤(DKI)是引起AKI的重要原因之一,特别是抗生素和抗肿瘤类药物对肾脏都有着严重的副作用,且在临床药物性肾损伤病例中顺铂(CDDP)和庆大霉素(GM)所引起的AKI所占比例较大。因此,科研工作者常利用这两类药物副作用建立动物模型进行肾损伤相关研究。AKI不仅危害人类的健康,同时对畜禽业也造成了危害。畜禽消化道细菌感染是危害养殖业的主要问题之一,沙门菌、大肠埃希菌等畜禽肠道细菌感染所致疾病的流行日趋复杂,也越来越难以控制,且不断出现新的流行与致病特点,不仅会造成严重的肠道疾病而且会引发死亡,造成极大的经济损失。氨基糖苷类抗生素因其具有良好的抗菌活性和较广的抗菌谱而被经常用于治疗畜禽革兰阴性菌感染,如沙门氏菌、大肠埃希菌等。GM是治疗畜禽革兰阴性菌感染最常见的氨基糖苷类抗生素,但其严重的肾毒性限制了其在临床上的应用。在此背景下,本研究通过构建CDDP和GM诱导的AKI动物模型进行肾损伤相关的机制及防治策略的研究无论在人医还是兽医都显得尤为重要。大量研究已经证实Nrf2信号通路是线粒体功能障碍、氧化应激和炎症的调节因子,是AKI的潜在治疗靶点,Nrf2的药理活化可能为AKI的临床防治提供新疗法。近年来,天然产物作为一种主要的Nrf2激活剂可以通过多种途径对抗氧化应激,调节Nrf2/ARE通路,用于各种疾病的防治与治疗在国内外已成为重要的研究方向。瑞香素(Daphnetin,Daph)是一种天香豆素衍生物,作为Nrf2的激活剂在临床上对某些疾病的防治可能有很好的疗效,但目前关于其在CDDP和GM刺激诱导的AKI的保护作用和机制还不清楚。本实验选用CDDP在HK2细胞和C57BL/6J小鼠分别构建体外和体内两种模型,探究瑞香素在体内外对CDDP诱导AKI的保护作用和机制。在HK2细胞,我们用CDDP诱导氧化应激、凋亡和炎症反应来研究其在细胞中的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用及机制,以及在人卵巢癌细胞系A2780、OVCAR-8和SKOV3细胞和人非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞分别检测瑞香素对CDDP抗癌活性的影响,在此过程中主要应用CCK8法、Hoehcst/PI染色法、流式细胞术(FCM)和免疫印迹法(Western Blot)等分子生物学方法。在C57BL/6J小鼠,我们用CDDP刺激小鼠构建AKI模型,检测瑞香素在CDDP诱导的小鼠AKI模型中的保护作用,并在细胞实验基础上进一步探究了其在小鼠AKI模型中氧化应激、凋亡和炎性损伤的保护机制,在这一基础上我们利用基因敲除小鼠再次探究其抗氧化机制、抗凋亡机制和抗炎机制三者之间的相互关系,以及构建C57BL/6J小鼠背部皮下B16黑色素肿瘤模型来研究瑞香素对CDDP肿瘤杀伤活性的影响,在此过程中主要应用HE染色、TUNEL染色和Western Blot等分子生物学方法。另外,再利用GM在m TEC细胞和ICR小鼠分别构建体外和体内两种模型,探究瑞香素在体内外对GM诱导AKI模型的保护作用和机制。在m TEC细胞,我们用GM诱导细胞氧化应激和凋亡观察其体外抗氧化和抗凋亡活性及机制。在此过程中主要应用CCK8法、Hoehcst/PI染色法和Western Blot等分子生物学方法。在ICR小鼠,我们用GM刺激小鼠构建AKI模型,检测瑞香素在GM诱导小鼠AKI模型中的保护作用,并在细胞实验基础上进一步探究了其在小鼠AKI模型中氧化应激和凋亡损伤的保护机制。在此过程中主要应用HE染色和Western Blot等分子生物学方法。实验结果表明:1.在HK2细胞中瑞香素展示出良好的抗氧化和抗凋亡活性,具体表现在其显著抑制CDDP诱导的细胞毒性、细胞凋亡和ROS的产生。瑞香素还上调了SIRT1/SIRT6/Nrf2/ARE通路并由此介导了其抗氧化活性,同时它还通过对MAPK、NF-κB和p53通路的抑制作用而发挥抗炎和抗凋亡活性。2.在m TEC细胞中瑞香素展示出良好的抗氧化和抗凋亡活性,具体表现在其显著抑制GM诱导的细胞毒性、细胞凋亡和ROS的产生。瑞香素上调了SIRT3/Nrf2/ARE通路并可能由此介导了其抗氧化活性。3.在C57BL/6J野生型小鼠,瑞香素显著改善了小鼠AKI模型中CDDP诱导的小鼠体重减轻,降低了肾指数、血BUN和CRE的升高,减轻小鼠肾肿大变白的程度以及肾组织的病理改变,还降低了肾组织中MPO和MDA的产生以及GSH和SOD的消耗。上述瑞香素的这些保护作用可能与其上调肾组织中SIRT1/SIRT6/Nrf2/ARE通路和抑制CDDP诱导的MAPK、NF-κB和p53通路的活化密切相关。4.相比于C57BL/6J野生型小鼠,Nrf2-/-小鼠的AKI模型中小鼠的体重减轻,肾指数、血BUN和CRE的升高,肾组织病理的改变,肾肿大变白的程度以及MAPK、NF-κB和p53通路的激活作用尤为明显,而给予瑞香素治疗后上述现象并未得到改善,表明了瑞香素在CDDP诱导的小鼠AKI模型中的保护作用及抗氧化、抗凋亡和抗炎活性均依赖Nrf2的介导。5.瑞香素不影响CDDP在人卵巢癌细胞系A2780、OVCAR-8和SKOV3细胞和人非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的抗癌活性,以及C57BL/6J小鼠背部皮下B16黑色素肿瘤模型的肿瘤杀伤活性。6.在ICR小鼠,瑞香素显著改善了小鼠AKI模型中GM诱导的小鼠血BUN和CRE的升高、肾组织病理的改变、小鼠肾肿大变白的程度,还降低了肾组织中MPO和MDA的产生以及GSH和SOD的消耗。上述瑞香素的这些保护作用可能与其上调肾组织中SIRT3/Nrf2/ARE通路和抑制GM诱导的p53通路的活化密切相关。综上所述,瑞香素通过上调SIRT1/SIRT3/SIRT6/Nrf2/ARE通路,从而抑制氧化应激、凋亡和炎症及线粒体功能紊乱,进而在CDDP/GM诱导的小鼠AKI模型中起到保护作用。因此,瑞香素有望同时应用于人类和动物中各种药物毒副作用的防治,从而改变或提高机体的抗病能力,保障人类的身体健康及减少畜禽养殖业的经济损失。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S853.74
【部分图文】：

1.3.1 瑞香素明显改善 CDDP 诱导的 HK2 细胞形态改变和细胞毒性HK2细胞经不同浓度瑞香素预处理1 h后，给予CDDP刺激24 h，倒置显微镜观察细胞形态，结果如图1.1所示，正常未处理的HK2细胞排列规则、均匀，细胞数量增加；与正常HK2细胞相比，单给CDDP刺激组细胞发生了明显的改变，具体表现为细胞死亡明显增多，活细胞数量则明显减少，且细胞出现明显的损伤如细胞核固缩、碎裂，细胞质内出现空泡，细胞皱缩且贴壁能力减弱；而给予不同浓度瑞香素组的HK2细胞的细胞损伤得到不同程度的改善，特别是瑞香素高剂量组。与之一致的是CCK8法测定的细胞存活率

特别是瑞香素高剂量组尤为明显，呈剂量依赖性，且不同浓度瑞香素组间在统计学上具有显著性差异。图1.2 瑞香素对CDDP诱导的HK2细胞凋亡的影响（Hoechst/PI染色）HK2细胞经不同浓度瑞香素预处理1 h后，给予CDDP刺激24 h，经Hoehcst/PI染色15min立即用荧光显微镜观察细胞形态和PI阳性细胞数。注， CDDP模型组与空白组相比，**P <0.01。Daph治疗组与CDDP模型组相比，#P < 0.05和##P < 0.01。1.3.3 瑞香素显著抑制 CDDP 诱导的 HK2 细胞凋亡HK2 细胞经不同浓度瑞香素预处理 1 h 后给予 CDDP 刺激 24 h，收集细胞并采用 FITC 和 PI 染色法，检测瑞香素对 CDDP 诱导 HK2 细胞凋亡/坏死的保护作用。如图 1.3 可见：与空白对照组相比

呈剂量依赖性，且不同浓度瑞香素组间在统计学上具有显著性差异。图1.3 瑞香素对CDDP诱导的HK2细胞凋亡的影响HK2细胞经不同浓度瑞香素预处理1 h后，给予CDDP刺激24 h，收集细胞并采用FITC和PI染色法运用流式细胞仪检测瑞香素对CDDP诱导HK2细胞凋亡/坏死的保护作用。注，
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本文编号：2836110