钩吻多组分的质谱裂解规律和定量方法学研究

发布时间：2020-10-14 09:09

　　 钩吻属马钱科植物中胡蔓藤的全草,在传统用药中常用于治疗类风湿关节炎疼痛、神经性疼痛和促进动物生长等;现代医学研究表明钩吻具有抗炎镇痛、免疫、抗肿瘤等药理活性,其生物碱和环烯醚萜是主要的活性成分。钩吻化学成分复杂,目前按已知药物研究思路分离到200多种化合物,但尚未进行钩吻的整体物质基础研究。因此,本文采用基于液相-质谱-数据库技术的中药化学成分快速识别技术,从而系统阐明钩吻中多种化学成分的结构,并研究钩吻多组分在无对照品下进行同时定量的关键技术。选择正交试验对流动相、分析时间和质谱模式三个方面进行LC-QqTOF/MS检测条件优化,最终优化后采用0.1%甲酸水-乙腈、50 min、Auto MS/MS正离子模式可得到钩吻化合物数目最多、响应最好的代谢物结果;然后,通过与建立的钩吻一级数据库进行匹配分析鉴定出31个目标化合物(甲基钩吻素乙类,11个;蛇根碱类,5个;钩吻素甲类,4个;环烯醚萜类,4个;钩吻素子类,2个,胡蔓藤碱乙类,2个;酚酸类,2个,育宾亨类,1个),并对其质谱裂解规律进行了研究,找到每类的诊断离子。再结合各种质谱各种数据分析策略共检测到非目标代谢物116个,其中甲基钩吻素乙类,41个;蛇根碱类,7个;钩吻素甲类,9个;环烯醚萜类,15个;钩吻素子类,5个,胡蔓藤碱乙类,14个;酚酸类,7个;其他,18。对其主要5类生物碱和环烯醚萜类等非生物碱的裂解规律进行分类结构表征,并结合MEGG和Massbank等数据库进行匹配,从而对未知代谢物进行了结构表征。建立了钩吻素甲和钩吻素子的HPLC定量检测方法,并对不同产地和部位的钩吻样品进行指纹图谱相似性分析,结果表明液相上至少有10个共有特征峰,仅用该两个化合物对钩吻进行质量控制具有一定局限性。因此,钩吻素甲和钩吻素子的质谱参数条件结合钩吻各组分鉴定,对多组分中的成分进行碰撞能量、分离条件的优化,最终确立了同时检测钩吻中41个化学成分的LC-MS/MS方法,并采用钩吻碱戊标准曲线相对定量研究了钩吻的不同部位中多组分的含量,结果表明化合物在钩吻不同部位存在显著性差异。如:钩吻素甲在叶中含量最高,可达到0.65 mg/g;钩吻素子在根中含量最大为1.08 mg/g,但在茎、叶中的含量差异小;钩吻素己在叶中含量最高为1.33 mg/g;钩吻碱戊在这四种化学成分中含量最低,在茎中仅有0.13 mg/g。钩吻素甲、钩吻素己和钩吻碱戊在三个部位有显着差异,而钩吻素子差异不显着,根中四个化合物的差异是非常显着的,叶中四个化合物存在显着差异。14-Hydroxygelsenicine在根和茎部位的含量是随着月份的增加逐渐有所积累,在茎中含量可达到1.198 mg/g;koumicine在12月新鲜藤中的含量最高为0.666 mg/g,19R-Hydroxydihydrogelsevirine或19S-Hydroxydihydrogelsevirine是钩吻中含量最高的化合物。通过以上研究,本文建立了基于液相-质谱-数据库技术的钩吻多组分快速鉴定的分析策略,全面系统阐明了钩吻的化学成分结构;解决了钩吻在无对照品下的定量分析技术难题。其研究结果不仅为钩吻质量控制及物质作用基础研究提供了技术支撑,而且为钩吻多组分的药代动力学研究和安全性评价奠定了科学依据。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S853.7
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 立项依据
    1.2 钩吻中化学成分的研究进展
        1.2.1 钩吻生物碱的研究
        1.2.2 非生物碱的研究
    1.3 中药化学成分的鉴定研究进展
        1.3.1 LC/MS和GC/MS的定性研究
        1.3.2 NMR的定性研究
    1.4 中药化学成分的定量研究进展
        1.4.1 中药色谱的定量研究方法及技术
        1.4.2 中药质谱的定量研究方法及技术
        1.4.3 钩吻化合物定量的研究
    1.5 研究内容与目标
第二章 LC-QqTOF/MS检测条件的优化研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试剂与药品
        2.1.2 主要仪器与设备
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 样品前处理
        2.1.5 钩吻中代谢物最佳优化条件的考察
        2.1.6 质谱条件
    2.2 结果
        2.2.1 不同条件对钩吻数量的影响
        2.2.2 不同条件对钩吻各组分强度的影响
        2.2.3 不同条件下钩吻化合物出峰时间的影响
        2.2.4 不同条件下对钩吻类别的影响
        2.2.5 不同二级模式对钩吻交集的25个化合物的影响
    2.3 讨论
    2.4 结论
第三章 基于钩吻数据库和各种分析策略对钩吻多组分的鉴定研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试剂与药品
        3.1.2 主要仪器与设备
        3.1.3 溶液配制
        3.1.4 样品采集
        3.1.5 质谱条件
        3.1.7 钩吻各组分鉴定的分析策略
    3.2 结果
        3.2.1 钩吻各组分的化学成分分析
        3.2.2 化学成分分析
        3.2.3 钩吻各组分的结构鉴定
            3.2.3.1 甲基钩吻素乙类生物碱
            3.2.3.2 蛇根碱类
            3.2.3.3 胡蔓藤碱乙类
            3.2.3.4 钩吻素子类
            3.2.3.5 钩吻素甲类
            3.2.3.6 环烯醚萜类
            3.2.3.7 酚酸类
            3.2.3.8 其他
    3.3 讨论
    3.4 结论
第四章 HPLC定量方法研究钩吻的指纹图谱
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试剂与药品
        4.1.2 主要仪器与设备
        4.1.3 溶液配制
        4.1.4 样品前处理
        4.1.5 液相色谱条件
        4.1.6 方法学考察
    4.2 结果
        4.2.1 HPLC定量方法结果
            4.2.1.1 精密度
            4.2.1.2 线性回归
            4.2.1.3 重复性试验
            4.2.1.4 稳定性试验
            4.2.1.5 加样回收率试验
        4.2.2 不同产地和部位的指纹图谱分析
            4.2.2.1 钩吻素甲与钩吻素子含量结果
            4.2.2.2 钩吻样品相似性结果
    4.3 讨论
    4.4 结论
第五章 钩吻多组分的LC-MS/MS定量方法学研究
    5.1 材料方法
        5.1.1 主要药品
        5.1.2 溶液配制
        5.1.3 样品采集
        5.1.4 主要仪器和设备
        5.1.5 四种钩吻生物碱的LC-MS/MS方法学研究
            5.1.5.1 钩吻定量分析液相方法的建立
            5.1.5.2 钩吻标准品线性范围的确立
            5.1.5.3 钩吻标准品的准确度与精密度
            5.1.4.4 钩吻样品的稳定性
            5.1.5.5 钩吻样品的重复性
        5.1.6 钩吻多组分的质谱条件优化
        5.1.7 钩吻根、茎、叶之间的差异性分析
    5.2 结果
        5.2.1 LC-MS/MS方法学考察结果
            5.2.1.1 方法专属性
            5.2.1.2 线性范围
            5.2.1.3 最低检测限
            5.2.1.4 定量限
            5.2.1.5 方法的精密度
        5.2.2 钩吻各组分的LC-MS/MS方法结果
            5.2.2.1 钩吻多组分的专属性分析
            5.2.2.2 钩吻的稳定性结果
            5.2.2.3 钩吻的重复性结果
        5.2.3 钩吻多组分LC-MS/MS的应用
            5.2.3.1 四种生物碱的定量结果
            5.2.3.2 钩吻41 个化合物的相对定量结果
        5.2.4 钩吻根、茎、叶差异性结果
    5.3 讨论
    5.4 结论
结论与创新点
参考文献
附图
缩略语表
致谢
作者简介

【参考文献】

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本文编号：2840461