转录因子Fur直接调控鸭疫里氏杆菌毒力的研究

发布时间：2020-10-20 07:42

　　 鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种细菌性传染病,临床剖检症状主要为全身浆膜的炎性渗出。本病在世界广泛分布,感染引起高发病率和死亡率,为我国法定的二类动物疫病。RA血清型众多且复杂,各血清型之间交叉保护性低,给该病的防治带来诸多困难。而且本病一旦发生很难彻底清除,主要以药物防治为主。因此加强RA的致病机制的研究,对从根本上预防该病的发生具有重要意义。铁是细菌生长和繁殖的关键性元素,广泛存在于细菌代谢途径中。但是过量的铁容易引起芬顿反应产生羟自由基进而对细胞产生毒害反应。铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)不仅调控细菌铁的稳态,并且能够与其它调控系统协同作用,直接或间接调控细菌的生长、代谢和毒力。但是Fur在RA中的作用尚不清楚。基因缺失是细菌分子生物学研究的基本工具,但目前还没有关于RA无抗性基因缺失株方法的报道。因此,本研究首先利用苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z,构建了RA-YM株fur基因无抗性缺失突变株。以野生型质粒p RA-JX为基础,构建了穿梭质粒p RES-JX-spc,利用该质粒构建回复株CΔfur。通过动物实验验证Fur与RA的毒力有关。利用转录组测序技术,筛选了鸭疫里氏杆菌基因组中受铁调控基因和受Fur调控基因,对Fur调节RA的毒力机制进行研究。具体内容如下:1.鸭疫里氏杆菌fur基因无抗性基因缺失突变株Δfur及回复株CΔfur的构建与鉴定本文首先构建了用于RA无抗性基因缺失突变株的自杀性质粒p RE-lac Z-mphe S-spc和回复株的穿梭质粒p RES-JX-spc。利用生长抑制试验发现RA对0.2%对氯苯丙氨酸敏感,证实phe S可以做为负筛选标记。通过对Phe S 301位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸,其它进行无义突变,野生型核苷酸序列与突变型核苷酸序列同源性71%,减少在该位点发生同源重组的概率。将突变型phe S与RA的rps L基因启动子融合构建mphe S表达盒。克隆lac Z基因,与rps L启动子融合,利用X-gal通过颜色可以直观的鉴定同源重组是否完成。以p RE112质粒为基础,结合抗性基因spc,负筛选标记phe S和指示标记lac Z连接构建自杀性质粒p RE-lac Z-mphe S-spc。克隆p RA-JX质粒的复制区域,构建穿梭质粒p RES-JX-spc,利用该质粒可以构建稳定遗传的回复突变菌株。构建了RA-YMΔfur无抗性基因缺失突变株和回复株CΔfur。克隆fur基因的左、右同源臂,利用重叠PCR将左右同源臂融合,通过酶切的方法并连接至自杀性质粒p RE-lac Z-mphe S-spc。以含有自杀性质粒p RE-lac Z-mphe S-spc-fur的E.coli X7213为供体菌,以RA-YM株为受体菌,通过两步同源重组法筛选得到RA-YMΔfur无抗性基因缺失突变株。第一步首先利用筛选标记spc筛选杂合体菌株,第二步利用筛选标记phe S和lac Z筛选无抗性基因缺失株。克隆fur基因启动子和编码区序列,利用重叠PCR融合fur基因启动子和编码区,通过酶切的方法连接到穿梭质粒p RES-JX-spc。以含有重组穿梭质粒p RES-JX-spc-fur的E.coli X7213为供体菌,以RA-YMΔfur为受体菌,利用筛选标记spc筛选回复株CΔfur。通过感染雏鸭测定RA-YMΔfur的致病性。动物试验结果显示野生株RA-YM、基因缺失突变株RA-YMΔfur和回复突株CΔfur的LD50分别为2.0×106 CFU,1.6×108CFU和1.2×107 CFU。RA-YMΔfur基因缺失突变株的毒力较野生株RA-YM毒力下降约80倍,回复株CΔfur的毒力较RA-YMΔfur毒力有所回升。对野生株RA-YM和RA-YMΔfur基因缺失突变株的血液和组织载菌量进行比较,结果显示RA-YMΔfur基因缺失突变株的载菌量均较野生株RA-YM低。另外组织剖检和病理切片观察,RA-YMΔfur基因缺失突变株引起的组织病变较野生株RA-YM轻微。证实fur基因与RA-YM株的毒力有关。2.转录因子Fur的转录调控基因的研究通过对RA-YM菌株和RA-YMΔfur菌株在限铁和富铁情况下的转录组进行比较,从全基因组水平上筛选受铁调控基因和受Fur调控基因。并随机挑选4个受铁调控的基因和4个受Fur调控的基因,利用荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组测序结果相符。转录组测序结果筛选出70个受铁调控基因和17个受Fur调控基因。转录组测序具体结果如下:限铁条件下,铁调控的基因中有45个基因表达上调。其中7个与细菌的铁运输和储存有关,6个与细菌的固氮过程有关,5个与氨基酸和辅酶的合成有关,5个与细胞表面结构与修饰有关,2个与嘌呤和核苷酸的合成有关;其余的与大分子的合成、转录调控功能以及未知功能等有关。限铁条件下,铁调控的基因中有25个基因表达下调。其中6个与三羧酸循环有关,7个与氧化应激有关,其余与细胞的转运功能以及未知功能等有关。Fur直接调控的基因有17个,其中5个参与铁的获取,2个参与氧化应激,1个为IX型分泌系统元件,其余参与氨基酸的合成和未知功能等。另外对Fur直接调控的基因启动子序列分析,预测得到Fur结合位点的序列为5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。利用p ET28a-fur质粒对Fur蛋白进行原核表达。扩增fur基因的编码区,通过酶切构建p ET28a-fur质粒,并转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞。利用IPTG诱导表达并利用His标签纯化柱纯化Fur蛋白。随机选择4个受Fur调控的基因,利用生物素标记的引物扩增其启动子序列,利用原核表达的Fur蛋白,通过凝胶迁移实验验证Fur蛋白与启动子的互作,结果显示Fur蛋白在体外可以与调控基因的启动子序列结合。综上所述,本试验成功的构建了基于苯丙氨酸-t RNA合成酶phe S和lac Z为筛选标记的无抗性基因缺失株方法,构建了fur基因缺失株RA-YMΔfur。构建了穿梭质粒p RES-JX-spc,利用该质粒构建了回复株CΔfur。通过动物实验验证fur基因与RA的毒力有关。并通过对RA-YM和RA-YMΔfur在限铁和富铁情况下的转录组进行比较,获得受铁调控基因以及Fur调控基因,预测得到RA的Fur-box序列为5’-ATTTAGAATTATTCTAAAT-3’。Fur通过调节铁摄取系统和氧化还原反应以及IX型分泌系统等,进而调节TCA循环相关酶类的表达,芳香族氨基酸,嘌呤和核苷酸的合成,影响RA的毒力。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

r and Choudhry 2010)。但是另一方面，铁过剩对细菌芬顿反应(Escolar et al 1999)。铁容易将电子传递自由基, 对细胞膜、DNA 和蛋白质等产生破坏(The必须保持在需要的限度之内。多种机制，使自身可以获得足够的铁的同时并维持多种途径摄取铁，一种途径是利用铁载体运输铁离微生物都能够大量合成铁载体。“铁载体”最初来载体是一类具有高度专一性的铁螯合剂，能够高特成受环境中铁浓度的影响(Stintzi et al 2000)。邻苯二菌素等均可结合 Fe3+(Henderson et al 2009)。分泌溶解铁，然后铁载体与 Fe3+特异性结合，通过 Ton隙，并与周质蛋白结合传递至 ABC 系统(ATP-bin胞质中，在细胞质中铁载体与 Fe3+分离，Fe3+被还原利用(K ster2001)。革兰氏阴性菌利用铁载体运输铁

图 1-2 Fur 蛋白的负调控机制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-2 The mechanism of iron-bound Fur repression控机制深入，发现 Fur 蛋白不仅有负调控机制，还存在一r 的调控模式还存在争议。但 Ernst 等发现在幽门、呼吸、能量代谢、趋药性、氧自由基的清除的al 2005a)。另外幽门螺杆菌中 prf，sodB 基因也受1; Ernst et al 2005b)。近年研究发现空肠弯曲杆菌Holems et al 2005)。的调控机制与 Fur 的负调控机制的不同之处是：负争结合位点，apo-Fur 调控机制是通过与转录抑制胞内 Fe2+不足时，apo-Fur 会与调控基因启动子的转转录抑制子的结合，从而使 RNA 聚合酶可以与调控基因顺利转录。但当胞内 Fe2+充足时，Fur 蛋白与 F

图 1-3 apo-Fur 的调控机制(Carpenter et al 2009)Fig. 1-3 The regulator mechanism of apo-Fur螺杆菌内，Fur-Fe2+复合物还可以诱导一些基因 oorD 基因、固氮作用相关的 nifS 基因均推测受z et al 2006;Alamuri et al 2006)。体结合在调控基因启动子上的核苷酸序列称为内发现，不同的细菌 Fur-box 序列并不完全相回文序列。ur-box 序列是一个大小为 19 bp 的核苷酸序列。基为轴的反向重复序列，序列为 GATAATGAT是“GATAAT”的 2-3 次重复形成的序列，Fur 序列从而结合到目标 DNA 上(Sebastian et al 强 Fur 的结合，这个模型可以解释大多数的 F
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本文编号：2848409