牛CMYA1核心启动子载体构建及小鼠早期胚胎制备

发布时间：2017-04-05 02:04

  本文关键词：牛CMYA1核心启动子载体构建及小鼠早期胚胎制备，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：CMYA1蛋白是心肌病相关蛋白,影响心脏的形态发育。CMYA1基因特异性的在心肌和骨骼肌中表达,并且在损伤的心肌细胞中会上调。本试验通过CMYA1基因的核心启动子连接二脂酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)构建载体,以期获得可以特异性改造牛肌肉性状的高效载体,为将来获得高产优质的转基因肉牛打下基础。首先对牛CMYA1核心启动子是否在牛肌肉中特异性启动目的基因的表达进行验证,具体操作是将试验室之前构建的由CMYA1核心启动子启动的pEGFP载体分别转染牛肌细胞和牛成纤维细胞。结果显示绿色荧光蛋白仅在牛肌细胞中表达。进一步验证牛CMYA1基因核心启动子的高效性,具体操作是将CMYA1核心启动子连接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1质粒中,命名为XD。将试验室之前构建的肌酸激酶启动子连接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1质粒中的载体命名为A293-4。载体XD、A293-4和空pcDNA3.1质粒分别转染C2C12细胞。相对定量PCR显示,XD组目的基因的表达量是A293-4组的6倍,是空质粒组的30倍,证明了CMYA1核心启动子具有高效性。本试验通过原核注射法将XD载体注入小鼠受精卵中,结果显示最佳的载体注射浓度为2mg/l,最佳的载体注射部位是雄原核,并成功的制备了小鼠的早期胚胎。为实验室接下来开展转基因小鼠动物模型的制备打下基础。结论:1牛CMYA1基因核心启动子具有牛肌细胞表达特异性。2牛CMYA1基因核心启动子可以肌细胞中高效的启动目的基因DGAT1的表达。3成功的制备了小鼠的早期胚胎。本试验的意义在于获得了特异性改变牛肌肉性状的高效载体,不但为将来获得具有优良肉质的转基因牛打下基础,而且为需要肌肉特异性表达载体的研究者提供了高效率并且特异性强的工具。
【关键词】：CMYA1核心启动子 肌肉特异性 高表达载体 原核注射
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要12-13
• ABSTRACT13-14
• 第一章 引言14-29
• 1 CMYA1基因的研究进展14-16
• 2 DGAT1基因的研究进展16-18
• 3 本试验采用的技术18-27
• 3.1 启动子克隆18-21
• 3.2 定量PCR技术21-22
• 3.3 载体构建技术22-25
• 3.4 细胞的培养与转染25-27
• 3.4.1 细胞培养25-26
• 3.4.2 细胞转染26-27
• 4 显微注射的研究进展27-28
• 5 本研究的目的与意义28-29
• 第二章 CMYA1基因核心启动子在牛肌肉细胞中的特异性表达29-34
• 1 材料29
• 1.1 细胞和菌液29
• 1.2 主要试剂和耗材29
• 1.3 主要仪器29
• 2 方法29-32
• 2.1 配置LB的液体培养基29
• 2.2 质粒的提取29-30
• 2.3 细胞培养30-31
• 2.3.1 细胞的复苏30-31
• 2.3.2 细胞的传代31
• 2.3.3 细胞的冻存31
• 2.4 XE载体转染牛的肌细胞和成纤维细胞31-32
• 3 结果与分析32-33
• 3.1 牛肌细胞的转染32
• 3.2 牛成纤维细胞的转染32-33
• 4 讨论33-34
• 第三章 牛CMYA1基因核心启动子高表达载体的构建及验证34-43
• 1 材料34
• 1.1 工具酶和试剂34
• 1.2 仪器设备34
• 1.3 测序和引物合成34
• 2 方法34-38
• 2.1 载体构建34-35
• 2.1.1 PCR反应34-35
• 2.1.2 质粒的酶切35
• 2.1.3 凝胶回收35
• 2.2 配置LB的固体培养基35-36
• 2.3 载体的连接36
• 2.4 载体的转化36-37
• 2.4.1 感受态的制备36
• 2.4.2 转化36-37
• 2.5 细胞转染37
• 2.6 细胞cDNA的获取37
• 2.6.1RNA抽提37
• 2.6.2 反转录37
• 2.7 PCR以及RT-PCR检测37-38
• 3 结果和分析38-41
• 3.1 载体构建38-39
• 3.2 细胞转染39-40
• 3.3 定量PCR40-41
• 4 讨论41-43
• 第四章 小鼠受精卵发育中XD载体的影响43-49
• 1 材料43
• 1.1 仪器和耗材43
• 1.2 试剂43
• 2 方法43-46
• 2.1 移卵针、持卵针、注射针的制备43-44
• 2.1.1 移卵针的拉制43
• 2.1.2 持卵针的拉制43
• 2.1.3 注射针的拉制43-44
• 2.2 试验动物选择44
• 2.3 雌性小鼠的超数排卵44
• 2.4 受精卵的采集及体外培养44
• 2.5 显微操作44-46
• 2.5.1 注射针的准备44-45
• 2.5.2 显微操作系统的准备45
• 2.5.3 显微注射45-46
• 3 结果和分析46-48
• 3.1 小鼠受精卵的收集46
• 3.2 XD载体浓度对小鼠受精卵发育的影响46-47
• 3.3 原和注射对小鼠受精卵发育的影响47-48
• 4 讨论48-49
• 第五章 结论49-50
• 参考文献50-56
• 致谢56-57
• 附录57-59
• 攻读学位期间发表的论文59

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本文编号：286268