鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其CRISPR位点的分布和结构特征

发布时间：2017-04-09 05:21

  本文关键词：鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其CRISPR位点的分布和结构特征，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, PM)是一种引起畜禽发生出血性败血症或传染性肺炎的病原菌,可在多种健康动物的口腔、咽部黏膜中存活。该菌广泛分布于世界各地,对养鸭业造成重大经济影响。由于抗生素滥用,使该菌耐药情况愈来愈严重。耐药基因的水平转移是多杀性巴氏杆菌获得耐药性的主要方式之一,而原核细胞中发现的CRISPR-Cas系统,能有效阻止基因水平转移。为今后深入探究多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统与其耐药性之间的关系,本课题首次对多杀性巴氏杆菌中CRISPR序列结构进行解析,并初步探讨了CRISPR位点与多杀性巴氏杆菌耐药情况之间的关系。本研究首先对来自4个不同规模化鸭场的疑似禽霍乱病料剖检,病鸭呈全身出血性败血症,心外膜、心冠脂肪大面积出血,全身黏膜、浆膜点状出血,肝脏有针尖状白色坏死灶等典型症状。经麦康凯培养基筛选、革兰染色、PCR、Biolog全自动微生物鉴定系统,获得4株临床分离株均为多杀性巴氏杆菌,经K-B纸片药敏实验均表现为多重耐药。为进一步分析多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统序列结构,先后提取4株临床分离株及7株实验室保存的多杀性巴氏杆菌全基因组,进行高通量测序,同时从NCBI下载11株多杀性巴氏杆菌全基因组序列,对总共22株多杀性巴氏杆菌基因组上的CRISPR-Cas系统进行比对。通过CRISPR-Cas系统分布情况,以及对先导序列、重复序列、间隔序列的分析,结果表明,在22株多杀性巴氏杆菌基因组上存在三种类型的CRISPR-Cas系统：Ⅰ-F型、Ⅱ-C型和Ⅲ-U型,且存在以下特征：1、每种CRISPR-Cas系统中,先导序列、重复序列及Cas蛋白三者之间相互影响；2、Ⅰ-F型系统中,重复序列第4位碱基突变对二级结构影响最大,Ⅲ-U型系统中,重复序列第9位碱基突变对二级结构影响最大；3、在三种系统中,共1314个间隔序列,但仅一例多杀性巴氏杆菌噬菌体F108与间隔序列匹配；4、不同地理位置分离的菌株,所包含的间隔序列数量存在差异。同时,为了解目前生产中多杀性巴氏杆菌的耐药情况与CRISPR位点之间的联系,本研究着重分析了4株临床分离株,结果显示间隔序列越少,菌株耐药性越强。本次研究对以后深入分析生产中多杀性巴氏杆菌的CRISPR-Cas系统与细菌耐药机制,特别是基因水平转移情况有重要意义,同时也为研究CRISPR与细菌毒力之间的关系、流行病检测、Cas蛋白等有关应用提供基础依据。
【关键词】：多杀性巴氏杆菌 分离鉴定 高通量测序 CRISPR-Cas系统 耐药性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-10
• 第一部分 文献综述10-19
• 1. 多杀性巴氏杆菌研究概况10-13
• 1.1 多杀性巴氏杆菌分类地位10
• 1.2 多杀性巴氏杆菌形态及染色特性10
• 1.3 多杀性巴氏杆菌培养及生化特性10-11
• 1.4 多杀性巴氏杆菌血清型11
• 1.5 多杀性巴氏杆菌抵抗力11
• 1.6 多杀巴氏杆菌的致病性及免疫性11-12
• 1.7 多杀巴氏杆菌的流行病学12
• 1.8 多杀性巴氏杆菌基因组学研究概况12-13
• 2. CRISPR-CAs系统研究概况13-18
• 2.1 CRISPR-Cas系统研究进展13-14
• 2.2 先导序列14
• 2.3 重复序列14
• 2.4 间隔序列14-15
• 2.5 Cas蛋白家族及CRISPR-Cas系统的分布及分类15-16
• 2.6 CRISPR-Cas系统的作用机制16
• 2.7 CRISPR-Cas系统与噬菌体的共进化16-17
• 2.8 CRISPR-Cas系统的生物信息学分析17-18
• 3. 研究目的及意义18-19
• 第二部分 鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定19-32
• 1. 试验材料19-21
• 1.1 菌株19-20
• 1.2 主要材料20-21
• 2. 实验方法21-27
• 2.1 临床分离株的分离培养及纯化21-22
• 2.2 临床分离株的革兰染色22
• 2.3 Biolog全自动细菌鉴定仪鉴定22-25
• 2.3.1 菌悬液制备22-23
• 2.3.2 微平板的接种于培养23-25
• 2.4 16S rDNA分子生物学鉴定25-26
• 2.5 Kirby-Bauer(K-B)药敏实验26-27
• 3. 结果27-31
• 3.1 分离结果27
• 3.2 培养特性27-28
• 3.3 革兰染色结果28
• 3.4 Biolog全自动细菌鉴定结果28-29
• 3.5 PCR鉴定结果29-30
• 3.6 耐药结果30-31
• 4. 讨论31-32
• 第三部分 鸭源多杀性巴氏杆菌中CRISPR-CAS系统的生物信息学分析32-56
• 1. 11株多杀性巴氏杆菌全基因组测序32-34
• 2. CRISPR-CAS系统的生物信息学分析结果34-48
• 2.1 测序结果34-35
• 2.2 CRISPR位点的分布35-37
• 2.3 先导序列的分析37-38
• 2.4 重复序列的分析38-43
• 2.5 间隔序列的分析43-45
• 2.6 Cas蛋白基因簇的分析45-48
• 3. 讨论48-56
• 3.1 多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统序列结构特征48-54
• 3.2 CRISPR位点与菌株耐药关系的初步探讨54-56
• 结论56-57
• 参考文献57-64
• 致谢64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡杰;赵国明;陆文俊;杨春龙;马丽丽;黄夏;刘棋;陆承平;;鸡多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J];中国家禽;2006年17期

2 安电进;曹树泽;刘尚高;;兔多杀性巴氏杆菌监测试验[J];河北畜牧兽医;1993年02期

3 刘建杰,吴斌,陈焕春;猪萎缩性鼻炎产毒多杀性巴氏杆菌的研究进展[J];动物医学进展;2002年01期

4 唐先春,吴斌,陈焕春;产毒多杀性巴氏杆菌研究进展[J];动物医学进展;2003年05期

5 唐先春,吴斌,索绪峰,王大林,陈焕春,尹争艳;猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J];畜牧兽医学报;2005年06期

6 曾静雯;刘慧芳;沈琴芳;郑新添;余旭平;吴彤;李永明;周碧君;王开功;;多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法[J];中国兽药杂志;2006年04期

7 杨发龙;张焕容;夏梦芸;于学辉;汤承;岳华;;禽A型多杀性巴氏杆菌的分离和鉴定[J];四川畜牧兽医;2008年05期

8 谭双;余旭平;黄贤波;;多杀性巴氏杆菌基因组分泌蛋白的预测分析[J];湖北农业科学;2009年11期

9 高明燕;徐步;赵宝华;范建华;龚建森;刘学贤;;多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展[J];动物医学进展;2010年01期

10 谢波;朱必凤;杨旭夫;;多杀性巴氏杆菌抗原的研究进展[J];韶关学院学报;2010年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 罗琼;李力施;林志雄;;从澳大利亚进口病死种羊中分离出多杀性巴氏杆菌[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

2 余旭平;朱军莉;何世成;王丽辉;牛冬;阮辉;;多杀性巴氏杆菌跨膜蛋白基因片段的克隆与分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

3 唐先春;吴斌;索绪峰;王大林;陈焕春;尹争艳;;猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

4 李任峰;戴金康;王绢;王三虎;郑玉姝;刘丽艳;;新乡地区兔巴氏杆菌的分离与鉴定[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年

5 杨宝凤;邹灵秀;李能章;黄园媛;吴建云;王自力;魏学良;彭远义;;6株牛源多杀性巴氏杆菌A型的分离鉴定及其部分生物学特性比较分析[A];第四届全国牛病防制及产业发展大会论文集[C];2012年

6 彭远义;;牛源多杀性巴氏杆菌A型相关研究[A];第四届全国牛病防制及产业发展大会论文集[C];2012年

7 杨宝凤;周伟;李能章;胡娟;夏天;徐亚丽;王自力;魏学良;吴建云;彭远义;;两株牛源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定[A];中国奶业协会第26次繁殖学术年会暨国家肉牛牦牛/奶牛产业技术体系第3届全国牛病防治学术研讨会论文集[C];2011年

8 龙青山;李能章;邹灵秀;黄园媛;杨宝凤;吴建云;王自力;魏学良;彭远义;;6株牛源多杀性巴氏杆菌A型主要毒力基因的比较分析[A];第四届全国牛病防制及产业发展大会论文集[C];2012年

9 李峰;沈志强;吴信明;刘吉山;林初文;;蜂胶对禽源多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌的抑菌试验[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年

10 王红琳;廖永洪;杨峻;罗玲;罗青平;艾地云;温国元;张蓉蓉;邵华斌;;湖北地方土鸡多杀性巴氏杆菌的分离和PCR鉴定[A];第二届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 山西太原神龙应用技术有限公司 李宝丽;猪多杀性巴氏杆菌感染的救治[N];中国畜牧报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 郭东春;多杀性巴氏杆菌兔体内差异表达基因及其突变株构建的研究[D];中国农业科学院;2012年

2 汤细彪;猪源多杀性巴氏杆菌的分子流行病学与致病性研究[D];华中农业大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马建伟;牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选及其融合蛋白免疫效果的研究[D];西南大学;2015年

2 冯思源;牛源多杀性巴氏杆菌粘附相关基因的体内表达及FimA蛋白功能的研究[D];西南大学;2015年

3 李春明;基于抗原抗体反应的牛源A型多杀性巴氏杆菌保护性抗原的筛选及鉴定[D];西南大学;2015年

4 杨敬;鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和生物学特性[D];四川农业大学;2015年

5 罗璇;鸭源多杀性巴氏杆菌油乳剂灭活疫苗的制备与应用[D];四川农业大学;2014年

6 常春龙;牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析[D];黑龙江八一农垦大学;2016年

7 任静静;牛多杀性巴氏杆菌通过NF-κB/MAPK-NLRP3/NLRP6诱导炎症反应研究[D];西南大学;2016年

8 李海娥;牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因筛选及初步分析[D];西南大学;2016年

9 孙久鹤;多杀性巴氏杆菌分型分析及其感染鸡IL-1β，IL-6转录变化研究[D];东北农业大学;2016年

10 刘顺磊;牛源A型巴氏杆菌的分离鉴定及菌影疫苗的初步研究[D];石河子大学;2016年

  本文关键词：鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其CRISPR位点的分布和结构特征，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：294554