脂联素对肉鸡脂肪代谢调控及其分子机制研究
发布时间：2024-06-23 12:24
本研究通过活体药物处理、构建超表达及干扰载体并处理鸡原代脂肪细胞、球状脂联素处理细胞等技术手段,研究脂联素对肉鸡活体脂肪沉积、肌肉品质和鸡脂肪细胞中脂代谢的影响及其调控机制。试验获得以下结果： 1.为了研究肉鸡脂联素表达变化对活体脂肪沉积及肌肉品质的影响,试验采用罗格列酮及地塞米松处理肉鸡,连续处理三周,检测血清中脂联素水平,脂联素及其受体基因的表达规律,同时研究肉鸡体脂沉积,检测脂肪组织中脂代谢关键基因的表达。结果表明：(1)罗格列酮显著上调肉鸡血清中脂联素水平,地塞米松显著抑制血清中脂联索水平,并呈时间依赖性；(2)罗格列酮显著上调腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝脏中脂联素及其受体AdipoR1基因的表达；(3)罗格列酮显著降低血清中TG和LDL-C水平,上调HDL-C水平,地塞米松显著上调血清中TG和LDL-C水平,下调HDL-C水平；(4)罗格列酮显著抑制腹脂和颈部皮脂以及胸肌和腿肌中的脂质沉积,而地塞米松显著增加肉鸡腹脂、腹部皮脂、颈部皮脂和腿部皮脂以及胸肌和腿肌中脂质沉积；(5)罗格列酮显著下调胸肌和腿肌中总FA、SFA和MUFA的含量,地塞米松则显著促进肌肉中脂肪酸的沉积；(6...
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 文献综述
第一章 文献综述
1.1 脂联素概述
1.1.1 脂肪组织的内分泌功能
1.1.2 脂联素的发现
1.1.3 脂联素的分子结构
1.1.4 脂联素受体
1.1.5 脂联素基因表达及调控
1.1.6 脂联素受体基因的表达及调控
1.1.7 脂联素对能量代谢和脂代谢的影响
1.2 脂肪细胞分化研究进展
1.2.1 前体脂肪细胞分化模型
1.2.2 脂肪细胞分化中分子事件
1.2.3 脂联素对于脂肪细胞分化的影响
1.3 线粒体研究综述
1.3.1 线粒体概括
1.3.2 线粒体与脂类代谢
1.3.3 脂联素与线粒体发育和功能
第二部分 试验研究
第二章 脂联素对肉鸡体脂沉积的影响
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物与饲养管理
2.1.2 试验分组与处理
2.1.3 基础日粮及营养水平
2.2 试剂和主要仪器设备
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器设备
2.3 样品采集和测定
2.3.1 屠宰和采样
2.3.2 生产性能测定
2.3.3 脂肪含量
2.3.4 血清中脂联素及血脂含量测定
2.3.5 Real-time PCR
2.3.5.1 RNA抽提
2.3.5.2 反转录
2.3.5.3 引物及退火温度
2.3.5.4 Real-time PCR反应体系
2.3.6 Western Blot
2.3.6.1 组织总蛋白的提取及含量测定
2.3.6.2 BCA法蛋白定量
2.3.6.3 蛋白质电泳
2.3.7 数据统计分析
2.4 结果
2.4.1 罗格列酮和地塞米松对肉鸡生产性能的影响
2.4.2 罗格列酮和地塞米松对肉鸡体内脂联素及其受体表达的影响
2.4.3 罗格列酮和地塞米松对肉鸡血脂水平以及体脂沉积的影响
2.4.4 罗格列酮和地塞米松对肉鸡组织中脂代谢相关基因表达的影响
2.5. 讨论
2.6 小结
第三章 脂联素对肉鸡肌肉中脂肪沉积及肉品质的影响
3.1 试验材料
3.1.1 试验动物与饲养管理
3.1.2 试验处理与分组
3.1.3 基础日粮及营养水平
3.2 试剂和主要仪器设备
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.3 样品采集和测定
3.3.1 屠宰和采样
3.3.2 IMF含量测定
3.3.3 血清中脂联素含量测定
3.3.4 肌肉品质测定
3.3.4.1 肌肉pH值
3.3.4.2 肉色测定
3.3.4.3 系水力
3.3.4.4 剪切力
3.3.4.5 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)
3.3.5 肌肉脂肪酸(fatty acid,FA)组成
3.3.6 Real-time PCR
3.3.7 Western Blot
3.3.8 数据统计分析
3.4 结果
3.4.1 血清脂联素水平、肌肉中脂联素及其受体基因的表达
3.4.2 肉品质分析
3.4.3 脂肪酸组成分析
3.4.4 罗格列酮和地塞米松对肌肉中脂代谢相关因子表达的影响
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 全长脂联素对鸡脂肪细胞中脂沉积的调控机制
4.1 试验材料
4.1.1 样品、菌株、质粒
4.1.2 主要试剂
4.1.3 常用试剂配制
4.2 试验方法
4.2.1 small-interfering RNA(siRNA)设计
4.2.2 鸡前体原代脂肪细胞的分离与培养
4.2.3 pcDNA3.1-ADPN及pGPU6/GFP/Neo重组质粒转染
4.2.4 细胞处理
4.2.5 转染重组质粒细胞ADPN mRNA和蛋白的检测
4.2.6 脂肪细胞油红0染色
4.2.7 培养基中游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和甘油释放
4.2.7.1 培养基中FFA测定
4.2.7.2 培养基中甘油测定
4.2.8 Real-time PCR检测脂代谢标志基因表达
4.2.9 Western blot检测脂代谢标志蛋白及信通路标志蛋白磷酸化水平
4.2.10 数据统计及分析
4.3 试验结果与分析
4.3.1 脂联素超表达载体和干扰载体的转染效率检测
4.3.2 超表达及干扰ADPN基因对鸡原代脂肪细胞中脂代谢的影响
4.3.3 超表达及干扰ADPN基因对鸡脂肪细胞中脂代谢关键基因表达的影响
4.3.4 超表达ADPN基因激活p38 MAPK/ATF-2信号通路
4.3.5 超表达ADPN抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 重组球状脂联素通过p38 MAPK和TOR信号通路抑制鸡原代脂肪细胞脂质蓄积
5.1 材料
5.1.1 材料
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器
5.2 试验方法
5.2.1 鸡前体脂肪细胞的分离培养
5.2.2 试验设计
5.2.3 油红O染色提取测胞内脂质蓄积
5.2.4 培养基中FFA的释放
5.2.5 实时定量检测脂代谢基因表达
5.2.6 Western蛋白印迹检测脂代谢相关蛋白以及通路磷酸化水平
5.2.7 数据分析
5.3 结果与分析
5.3.1 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞内源脂联素及其受体表达的影响
5.3.2 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞脂质沉积的影响
5.3.3 球状脂联素在鸡脂肪细胞中激活p38 MAPK/ATF-2信号通路
5.3.4 球状脂联素在鸡脂肪细胞中抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路
5.3.5 球状脂联素与p38 MAPK通路对脂肪细胞分化的影响
5.3.6 球状脂联素与TOR通路对脂肪细胞分化的影响
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 脂联素对鸡脂肪细胞分化及线粒体发育和功能调控机制
6.1. 材料与方法
6.1.1 试验材料
6.1.1.1 试验动物、腺病毒、质粒
6.1.1.2 主要试验试剂
6.1.1.3 主要试验仪器
6.1.2 试验方法
6.1.2.1 主要溶液配制
6.1.2.2 肉鸡原代脂肪细胞培养
6.1.2.3 细胞处理
6.1.2.4 细胞形态观察、油红O染色及Bodipy染色
6.1.2.5 透射电镜观察线粒体数目
6.1.2.6 JC-1染色检测线粒体膜通透性
6.1.2.7 JC-1染色流式细胞术
6.1.2.8 Cyt-c免疫荧光分析
6.1.2.9 细胞总RNA提取及Realtime-PCR检测脂代谢及线粒体标志基因表达
6.1.2.10 细胞总蛋白收取及Westernblot检测脂代谢、线粒体中标志蛋白和通路蛋白磷酸化水平
6.1.2.11 葡萄糖摄取率及培养基中游离脂肪酸含量检测
6.1.3 数据处理及分析
6.2 试验结果
6.2.1 超表达及干扰效率检测
6.2.2 脂联素对脂肪细胞中脂代谢的影响
6.2.3 脂联素对鸡原代脂肪细胞脂代谢基因表达的影响
6.2.4 脂联素对鸡原代脂肪细胞葡萄糖摄取及脂解影响
6.2.5 脂联素对鸡原代脂肪细胞线粒体发育的影响
6.2.6 脂联素对鸡原代脂肪细胞中Cyt-C表达影响
6.2.7 脂联素对线粒体中糖脂代谢相关标志基因及蛋白表达的影响
6.2.8 脂联素对鸡脂肪细胞线粒体通透性的影响
6.2.9 脂联素对鸡原代脂肪细胞中相关信号通路的影响
6.3 讨论
6.4 小结
结论与进一步研究计划
参考文献
缩略词
致谢
作者简介
本文编号：3995464
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 文献综述
第一章 文献综述
1.1 脂联素概述
1.1.1 脂肪组织的内分泌功能
1.1.2 脂联素的发现
1.1.3 脂联素的分子结构
1.1.4 脂联素受体
1.1.5 脂联素基因表达及调控
1.1.6 脂联素受体基因的表达及调控
1.1.7 脂联素对能量代谢和脂代谢的影响
1.2 脂肪细胞分化研究进展
1.2.1 前体脂肪细胞分化模型
1.2.2 脂肪细胞分化中分子事件
1.2.3 脂联素对于脂肪细胞分化的影响
1.3 线粒体研究综述
1.3.1 线粒体概括
1.3.2 线粒体与脂类代谢
1.3.3 脂联素与线粒体发育和功能
第二部分 试验研究
第二章 脂联素对肉鸡体脂沉积的影响
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物与饲养管理
2.1.2 试验分组与处理
2.1.3 基础日粮及营养水平
2.2 试剂和主要仪器设备
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器设备
2.3 样品采集和测定
2.3.1 屠宰和采样
2.3.2 生产性能测定
2.3.3 脂肪含量
2.3.4 血清中脂联素及血脂含量测定
2.3.5 Real-time PCR
2.3.5.1 RNA抽提
2.3.5.2 反转录
2.3.5.3 引物及退火温度
2.3.5.4 Real-time PCR反应体系
2.3.6 Western Blot
2.3.6.1 组织总蛋白的提取及含量测定
2.3.6.2 BCA法蛋白定量
2.3.6.3 蛋白质电泳
2.3.7 数据统计分析
2.4 结果
2.4.1 罗格列酮和地塞米松对肉鸡生产性能的影响
2.4.2 罗格列酮和地塞米松对肉鸡体内脂联素及其受体表达的影响
2.4.3 罗格列酮和地塞米松对肉鸡血脂水平以及体脂沉积的影响
2.4.4 罗格列酮和地塞米松对肉鸡组织中脂代谢相关基因表达的影响
2.5. 讨论
2.6 小结
第三章 脂联素对肉鸡肌肉中脂肪沉积及肉品质的影响
3.1 试验材料
3.1.1 试验动物与饲养管理
3.1.2 试验处理与分组
3.1.3 基础日粮及营养水平
3.2 试剂和主要仪器设备
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.3 样品采集和测定
3.3.1 屠宰和采样
3.3.2 IMF含量测定
3.3.3 血清中脂联素含量测定
3.3.4 肌肉品质测定
3.3.4.1 肌肉pH值
3.3.4.2 肉色测定
3.3.4.3 系水力
3.3.4.4 剪切力
3.3.4.5 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)
3.3.5 肌肉脂肪酸(fatty acid,FA)组成
3.3.6 Real-time PCR
3.3.7 Western Blot
3.3.8 数据统计分析
3.4 结果
3.4.1 血清脂联素水平、肌肉中脂联素及其受体基因的表达
3.4.2 肉品质分析
3.4.3 脂肪酸组成分析
3.4.4 罗格列酮和地塞米松对肌肉中脂代谢相关因子表达的影响
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 全长脂联素对鸡脂肪细胞中脂沉积的调控机制
4.1 试验材料
4.1.1 样品、菌株、质粒
4.1.2 主要试剂
4.1.3 常用试剂配制
4.2 试验方法
4.2.1 small-interfering RNA(siRNA)设计
4.2.2 鸡前体原代脂肪细胞的分离与培养
4.2.3 pcDNA3.1-ADPN及pGPU6/GFP/Neo重组质粒转染
4.2.4 细胞处理
4.2.5 转染重组质粒细胞ADPN mRNA和蛋白的检测
4.2.6 脂肪细胞油红0染色
4.2.7 培养基中游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和甘油释放
4.2.7.1 培养基中FFA测定
4.2.7.2 培养基中甘油测定
4.2.8 Real-time PCR检测脂代谢标志基因表达
4.2.9 Western blot检测脂代谢标志蛋白及信通路标志蛋白磷酸化水平
4.2.10 数据统计及分析
4.3 试验结果与分析
4.3.1 脂联素超表达载体和干扰载体的转染效率检测
4.3.2 超表达及干扰ADPN基因对鸡原代脂肪细胞中脂代谢的影响
4.3.3 超表达及干扰ADPN基因对鸡脂肪细胞中脂代谢关键基因表达的影响
4.3.4 超表达ADPN基因激活p38 MAPK/ATF-2信号通路
4.3.5 超表达ADPN抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 重组球状脂联素通过p38 MAPK和TOR信号通路抑制鸡原代脂肪细胞脂质蓄积
5.1 材料
5.1.1 材料
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器
5.2 试验方法
5.2.1 鸡前体脂肪细胞的分离培养
5.2.2 试验设计
5.2.3 油红O染色提取测胞内脂质蓄积
5.2.4 培养基中FFA的释放
5.2.5 实时定量检测脂代谢基因表达
5.2.6 Western蛋白印迹检测脂代谢相关蛋白以及通路磷酸化水平
5.2.7 数据分析
5.3 结果与分析
5.3.1 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞内源脂联素及其受体表达的影响
5.3.2 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞脂质沉积的影响
5.3.3 球状脂联素在鸡脂肪细胞中激活p38 MAPK/ATF-2信号通路
5.3.4 球状脂联素在鸡脂肪细胞中抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路
5.3.5 球状脂联素与p38 MAPK通路对脂肪细胞分化的影响
5.3.6 球状脂联素与TOR通路对脂肪细胞分化的影响
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 脂联素对鸡脂肪细胞分化及线粒体发育和功能调控机制
6.1. 材料与方法
6.1.1 试验材料
6.1.1.1 试验动物、腺病毒、质粒
6.1.1.2 主要试验试剂
6.1.1.3 主要试验仪器
6.1.2 试验方法
6.1.2.1 主要溶液配制
6.1.2.2 肉鸡原代脂肪细胞培养
6.1.2.3 细胞处理
6.1.2.4 细胞形态观察、油红O染色及Bodipy染色
6.1.2.5 透射电镜观察线粒体数目
6.1.2.6 JC-1染色检测线粒体膜通透性
6.1.2.7 JC-1染色流式细胞术
6.1.2.8 Cyt-c免疫荧光分析
6.1.2.9 细胞总RNA提取及Realtime-PCR检测脂代谢及线粒体标志基因表达
6.1.2.10 细胞总蛋白收取及Westernblot检测脂代谢、线粒体中标志蛋白和通路蛋白磷酸化水平
6.1.2.11 葡萄糖摄取率及培养基中游离脂肪酸含量检测
6.1.3 数据处理及分析
6.2 试验结果
6.2.1 超表达及干扰效率检测
6.2.2 脂联素对脂肪细胞中脂代谢的影响
6.2.3 脂联素对鸡原代脂肪细胞脂代谢基因表达的影响
6.2.4 脂联素对鸡原代脂肪细胞葡萄糖摄取及脂解影响
6.2.5 脂联素对鸡原代脂肪细胞线粒体发育的影响
6.2.6 脂联素对鸡原代脂肪细胞中Cyt-C表达影响
6.2.7 脂联素对线粒体中糖脂代谢相关标志基因及蛋白表达的影响
6.2.8 脂联素对鸡脂肪细胞线粒体通透性的影响
6.2.9 脂联素对鸡原代脂肪细胞中相关信号通路的影响
6.3 讨论
6.4 小结
结论与进一步研究计划
参考文献
缩略词
致谢
作者简介
本文编号：3995464
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