E2蛋白介导的猪瘟兔化弱毒疫苗适应家兔的分子机制
发布时间：2021-01-14 18:41
病毒在非易感细胞或宿主中连续传代后,适应非易感细胞或宿主,同时在自然宿主中的毒力减弱,从而获得弱毒疫苗。猪瘟兔化弱毒疫苗（C株或HCLV株）是在20世纪50年代将猪瘟病毒强毒株在家兔体内连续传480余代获得的一株弱毒疫苗。与猪瘟强毒Shimen株相比,C株能够适应家兔,对猪无致病性。本实验室前期发现,E2蛋白是C株适应家兔的关键蛋白。那么,E2蛋白是如何介导C株适应家兔的?决定猪瘟病毒适应家兔的分子基础是否影响病毒在猪体内的毒力?为解析E2蛋白介导的C株适应家兔的分子机制,首先确定了C株适应家兔的E2蛋白关键氨基酸。以C株为骨架构建了包含Shimen株E2蛋白不同结构域的嵌合病毒,通过家兔接种试验发现位于E2蛋白Domain I是C株适应家兔的关键结构域。下一步,对Domain I中的差异氨基酸进一步分析,发现Domain I-2中的三个氨基酸位点（K105、P108和T109）能够决定C株对家兔的适应性。那么这三个位点中具体哪个氨基酸在C株适应家兔中发挥作用呢?因此,构建了单独突变和两两组合突变的突变体病毒,通过家兔接种试验发现,P108和T109是C株适应家兔的E2蛋白关键氨基酸。...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：86 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
猪只感染猪瘟病毒后的临床症状
猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是猪瘟的病原体,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、边界病病毒(Border disease virus)也属于该病毒属(王汉中,1996)。病毒颗粒的囊膜包含4个结构蛋白,分别是衣壳C蛋白和囊膜糖蛋白Erns、E1和E2。C蛋白内有一条12.3 kb的单股正链RNA基因组,该基因组包含一个长的开放阅读框,阅读框的编码区可以编码一个多聚蛋白,位于编码区两侧的分别为5′非编码区和3′非编码区(Untranslated region,UTR)。编码的多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的作用下产生13个成熟蛋白(李军等,2007),包括已提到的4个结构蛋白,Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 8个非结构蛋白(图1-2)。13个成熟蛋白在病毒的生命周期与感染过程中发挥不同的功能:(1)CSFV的非编码区结构及其功能
HCV主要导致慢性肝炎,而全世界大约有1.8亿慢性肝炎患者(LOHMANN et al.,1999;MOHD et al.,2013)。然而,由于缺乏细胞培养系统,导致药物和疫苗的研发受阻(WAKITA et al.,2005)。HCV的感染需要特定宿主因子来满足病毒的侵入、RNA复制、组装和病毒颗粒的释放。HCV侵入细胞需要多个宿主因子的共同参与,最初病毒颗粒的吸附需要病毒核心蛋白、囊膜蛋白E1和E2与脂蛋白、黏多糖、凝集素、低密度脂蛋白受体在内的多个宿主蛋白相互作用。除此之外,已鉴定的侵入因子包括B类1型清道夫受体(Scavenger receptor class B type 1,SR-BI)、四跨膜蛋白CD81、紧密连接类蛋白中的闭合蛋白1(Claudin-1,CLDN1)和封闭蛋白(Occludin,OCLN)。在多种哺乳类动物细胞系过表达这四类分子可以使非易感细胞获得对HCV的容许性(PLOSS et al.,2009)。利用HCV复制子研究发现鼠源肝癌细胞能够支持HCV的RNA进行复制,同时在过表达人源侵入分子后,HCV也能够侵入啮齿类动物细胞(ZHU et al.,2003)。这些证据表明与具有物种特异性的四种侵入受体的结合决定了HCV的宿主嗜性。不同物种CD81分子的胞外环结构域差异性很大,而此结构域决定了其与HCV E2蛋白的相互作用。Bitzegeio(2010)将HCV Jc1株感染过表达鼠源CD81而不表达人源CD81的细胞(Lunet N mCD81),连续传代后发现4个突变体位点,其中位于病毒糖蛋白的3个位点的突变(E1-L216R、E2-V388G、E2-M405T)提高了病毒侵入Lunet N mCD81的效率。与亲本病毒相比,3个点突变增强了病毒利用鼠源CD81受体的能力。利用可溶性蛋白阻断试验和抗体封闭试验进一步研究表明,三个位突变点很可能是促进了病毒上CD81结合位点的暴露;受体竞争试验表明,突变体病毒对SR-BI的依赖性降低。而另一个可能的机制就是改变了病毒糖蛋白复合体的构象,因为抗体中和试验发现突变体病毒与抗E2特应性抗体和抗E2蛋白羧基端特应性抗体的结合能力增强。但是由于HCV E1/E2复合物结构未知,不能最终确定上述机制研究是否互悖(BITZEGEIO et al.,2010)。人/猴免疫缺陷嵌合病毒(Simian–human immunodeficiency virus,SHIV)是以猕猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus of macaque,SIVmac)为骨架表达HIV的膜蛋白,其对于HIV疫苗的研发和治疗具有重要的应用前景(SHARMA et al.,2015)。据报道,利用SHIV可以评估广谱中和抗体的诱导水平、广谱单克隆中和抗体在临床前试验中的抑制和治愈效果等(WALKER et al.,2011;YAMAMOTO et al.,2015;BAROUCH et al.,2013)。但是恒河猴作为HIV-1感染人类的动物模型而言存在显著不足,即HIV-1 Env可以感染人类CD4+T细胞,而不能感染恒河猴CD4(rhesus CD4,rh CD4)T细胞(FINZI et al.,2012),使得该系统的应用受限。HIV-1 Env与受体CD4的相互作用,介导病毒感染细胞,因此需要从宿主受体CD4和病毒蛋白Env两个角度阐明HIV-1 Env不能感染rhCD4 T细胞的分子机制。人CD4的N-末端免疫球蛋白样结构域(D1)是与HIV-1 Env相互作用的主要结构域,人源CD4与rh CD4的D1存在21个氨基酸的差异。Humes等研究表明,CD4受体中第39位氨基酸决定了HIV-1能否侵入靶细胞的种族差异性(HUMES et al.,2012)。结构分析表明,人源CD4中的N39非常接近F43或R59,而F43或R59可以与gp120形成氢键使得吸附更加稳定(KWONG et al.,1998)。虽然CD4 I39是阻碍HIV-1 Env结合rh CD4的关键改变,但huCD4中的相应残基(N39)实际上并不直接与HIV-1 Env相互作用,而是处于闭合状态(融合前)或CD4结合状态。相反,它临近苯丙氨酸43(F43)残基,与F43结合口袋中的Env残基相互作用。在rh CD4中,通过模拟显示,I39可以巧妙地改变F43结合环的角度。HIV-1 Env与CD4的结合需要多次结构重组,而侧链体积会显著影响该重构从而影响二者的相互作用。Li(2016a)通过分析SIV和HIV-1与CD4结合的Env残基在配体结合中体积,发现HIV-1中第375位是丝氨酸,而在SIV中通常为体积较大的疏水性氨基酸,同时该位点不论在融合前还是与CD4结合时均与CD4的F43非常接近,并且在灵长类慢病毒中具有很大的进化压力。将第375位丝氨酸突变为来源于不同Env骨架的氨基酸后可以增加Env对恒河猴CD4的亲和性,使得病毒可以侵入表达rhCD4的细胞,还可使病毒可以在原代rhCD4 T细胞中复制。Env内部结构域gp120在结合CD4时自我折叠,其内部、外部和桥接片状结构域在与CD4的界面处接近。这个过程会在HIV-1 gp120和CD4之间产生~150-?3腔,尽管Env蛋白第375位氨基酸不是其中之一,但它与保守的gp120残基有许多接触(ZHOU et al.,2007)。已有报道称,HIV-1 gp120突变后即S375W可以填充该腔,使得该蛋白的结构能够自发地向与CD4结合时的状态进行转变,从而提高了与人源CD4的亲和性(FINZI et al.,2010)。同样,以不同的氨基酸替换SHIV Env蛋白第375位氨基酸很有可能是以相同的机制促进与rh CD4的结合。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟综合防控研究进展[J]. 任世斌,赵亮,郭抗抗,林青. 动物医学进展. 2018(09)
[2]猪瘟病毒蛋白的结构与功能[J]. 李军,杨威,陈凤莲,赵武. 上海畜牧兽医通讯. 2007(06)
[3]猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J]. 仇华吉,童光志,沈荣显. 中国农业科学. 2005(08)
[4]RNA病毒的反向遗传学[J]. 薛强,仇华吉,童光志. 生物技术通报. 2001(04)
[5]猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究[J]. 余兴龙,涂长春,李红卫,陈创夫,李作生,马正海,孙明,殷震. 中国病毒学. 2000(03)
[6]几种瘟病毒分子生物学研究进展[J]. 王汉中. 国外兽医学.畜禽疾病. 1996(01)
硕士论文
[1]猪瘟病毒致病的临床生物学特性研究[D]. 徐凤军.山东农业大学 2005
本文编号：2977339
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：86 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
猪只感染猪瘟病毒后的临床症状
猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是猪瘟的病原体,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、边界病病毒(Border disease virus)也属于该病毒属(王汉中,1996)。病毒颗粒的囊膜包含4个结构蛋白,分别是衣壳C蛋白和囊膜糖蛋白Erns、E1和E2。C蛋白内有一条12.3 kb的单股正链RNA基因组,该基因组包含一个长的开放阅读框,阅读框的编码区可以编码一个多聚蛋白,位于编码区两侧的分别为5′非编码区和3′非编码区(Untranslated region,UTR)。编码的多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的作用下产生13个成熟蛋白(李军等,2007),包括已提到的4个结构蛋白,Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 8个非结构蛋白(图1-2)。13个成熟蛋白在病毒的生命周期与感染过程中发挥不同的功能:(1)CSFV的非编码区结构及其功能
HCV主要导致慢性肝炎,而全世界大约有1.8亿慢性肝炎患者(LOHMANN et al.,1999;MOHD et al.,2013)。然而,由于缺乏细胞培养系统,导致药物和疫苗的研发受阻(WAKITA et al.,2005)。HCV的感染需要特定宿主因子来满足病毒的侵入、RNA复制、组装和病毒颗粒的释放。HCV侵入细胞需要多个宿主因子的共同参与,最初病毒颗粒的吸附需要病毒核心蛋白、囊膜蛋白E1和E2与脂蛋白、黏多糖、凝集素、低密度脂蛋白受体在内的多个宿主蛋白相互作用。除此之外,已鉴定的侵入因子包括B类1型清道夫受体(Scavenger receptor class B type 1,SR-BI)、四跨膜蛋白CD81、紧密连接类蛋白中的闭合蛋白1(Claudin-1,CLDN1)和封闭蛋白(Occludin,OCLN)。在多种哺乳类动物细胞系过表达这四类分子可以使非易感细胞获得对HCV的容许性(PLOSS et al.,2009)。利用HCV复制子研究发现鼠源肝癌细胞能够支持HCV的RNA进行复制,同时在过表达人源侵入分子后,HCV也能够侵入啮齿类动物细胞(ZHU et al.,2003)。这些证据表明与具有物种特异性的四种侵入受体的结合决定了HCV的宿主嗜性。不同物种CD81分子的胞外环结构域差异性很大,而此结构域决定了其与HCV E2蛋白的相互作用。Bitzegeio(2010)将HCV Jc1株感染过表达鼠源CD81而不表达人源CD81的细胞(Lunet N mCD81),连续传代后发现4个突变体位点,其中位于病毒糖蛋白的3个位点的突变(E1-L216R、E2-V388G、E2-M405T)提高了病毒侵入Lunet N mCD81的效率。与亲本病毒相比,3个点突变增强了病毒利用鼠源CD81受体的能力。利用可溶性蛋白阻断试验和抗体封闭试验进一步研究表明,三个位突变点很可能是促进了病毒上CD81结合位点的暴露;受体竞争试验表明,突变体病毒对SR-BI的依赖性降低。而另一个可能的机制就是改变了病毒糖蛋白复合体的构象,因为抗体中和试验发现突变体病毒与抗E2特应性抗体和抗E2蛋白羧基端特应性抗体的结合能力增强。但是由于HCV E1/E2复合物结构未知,不能最终确定上述机制研究是否互悖(BITZEGEIO et al.,2010)。人/猴免疫缺陷嵌合病毒(Simian–human immunodeficiency virus,SHIV)是以猕猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus of macaque,SIVmac)为骨架表达HIV的膜蛋白,其对于HIV疫苗的研发和治疗具有重要的应用前景(SHARMA et al.,2015)。据报道,利用SHIV可以评估广谱中和抗体的诱导水平、广谱单克隆中和抗体在临床前试验中的抑制和治愈效果等(WALKER et al.,2011;YAMAMOTO et al.,2015;BAROUCH et al.,2013)。但是恒河猴作为HIV-1感染人类的动物模型而言存在显著不足,即HIV-1 Env可以感染人类CD4+T细胞,而不能感染恒河猴CD4(rhesus CD4,rh CD4)T细胞(FINZI et al.,2012),使得该系统的应用受限。HIV-1 Env与受体CD4的相互作用,介导病毒感染细胞,因此需要从宿主受体CD4和病毒蛋白Env两个角度阐明HIV-1 Env不能感染rhCD4 T细胞的分子机制。人CD4的N-末端免疫球蛋白样结构域(D1)是与HIV-1 Env相互作用的主要结构域,人源CD4与rh CD4的D1存在21个氨基酸的差异。Humes等研究表明,CD4受体中第39位氨基酸决定了HIV-1能否侵入靶细胞的种族差异性(HUMES et al.,2012)。结构分析表明,人源CD4中的N39非常接近F43或R59,而F43或R59可以与gp120形成氢键使得吸附更加稳定(KWONG et al.,1998)。虽然CD4 I39是阻碍HIV-1 Env结合rh CD4的关键改变,但huCD4中的相应残基(N39)实际上并不直接与HIV-1 Env相互作用,而是处于闭合状态(融合前)或CD4结合状态。相反,它临近苯丙氨酸43(F43)残基,与F43结合口袋中的Env残基相互作用。在rh CD4中,通过模拟显示,I39可以巧妙地改变F43结合环的角度。HIV-1 Env与CD4的结合需要多次结构重组,而侧链体积会显著影响该重构从而影响二者的相互作用。Li(2016a)通过分析SIV和HIV-1与CD4结合的Env残基在配体结合中体积,发现HIV-1中第375位是丝氨酸,而在SIV中通常为体积较大的疏水性氨基酸,同时该位点不论在融合前还是与CD4结合时均与CD4的F43非常接近,并且在灵长类慢病毒中具有很大的进化压力。将第375位丝氨酸突变为来源于不同Env骨架的氨基酸后可以增加Env对恒河猴CD4的亲和性,使得病毒可以侵入表达rhCD4的细胞,还可使病毒可以在原代rhCD4 T细胞中复制。Env内部结构域gp120在结合CD4时自我折叠,其内部、外部和桥接片状结构域在与CD4的界面处接近。这个过程会在HIV-1 gp120和CD4之间产生~150-?3腔,尽管Env蛋白第375位氨基酸不是其中之一,但它与保守的gp120残基有许多接触(ZHOU et al.,2007)。已有报道称,HIV-1 gp120突变后即S375W可以填充该腔,使得该蛋白的结构能够自发地向与CD4结合时的状态进行转变,从而提高了与人源CD4的亲和性(FINZI et al.,2010)。同样,以不同的氨基酸替换SHIV Env蛋白第375位氨基酸很有可能是以相同的机制促进与rh CD4的结合。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟综合防控研究进展[J]. 任世斌,赵亮,郭抗抗,林青. 动物医学进展. 2018(09)
[2]猪瘟病毒蛋白的结构与功能[J]. 李军,杨威,陈凤莲,赵武. 上海畜牧兽医通讯. 2007(06)
[3]猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J]. 仇华吉,童光志,沈荣显. 中国农业科学. 2005(08)
[4]RNA病毒的反向遗传学[J]. 薛强,仇华吉,童光志. 生物技术通报. 2001(04)
[5]猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究[J]. 余兴龙,涂长春,李红卫,陈创夫,李作生,马正海,孙明,殷震. 中国病毒学. 2000(03)
[6]几种瘟病毒分子生物学研究进展[J]. 王汉中. 国外兽医学.畜禽疾病. 1996(01)
硕士论文
[1]猪瘟病毒致病的临床生物学特性研究[D]. 徐凤军.山东农业大学 2005
本文编号：2977339
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