一株莫拉氏菌新种的分离鉴定与特性研究

发布时间：2017-04-11 06:03

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【摘要】：莫拉氏菌(moraxella),是一种革兰氏阴性菌,有抗褪色倾向,归属于莫拉氏菌科。该菌多寄生于人或其它温血动物的黏膜上,是一种机会性致病菌。莫拉氏菌通常为杆状或球杆状。杆菌短而饱满,接近球形,球形菌通常较小,单个或成对存在。该菌在有氧环境下生长良好,在缺氧环境下可微弱生长。菌落不产生色素,通常氧化酶和触酶阳性。不产酸以及碳水化合物。对青霉素敏感。DNA的G+Cmol%为40.0-47.5。本研究从四川绵阳地区鸭场分离到一株革兰氏阴性球菌。该菌伴随鸭疫里默氏菌被分离。并在此基础上对其形态学、培养特性、生长特性、生化特性等进行了考察。其16S rRNA基因序列与莫拉氏菌属细菌同源性最高可达到97%。初步鉴定为莫拉氏菌属的一个新种。该分离株在显微镜下可见短杆状,双球或短链状排列。多数成对排列,亦有单个排列。在巧克力平板上形成圆形、淡黄色、边缘整齐、表面光滑、不透明、湿润、黏稠、扁平、大小均一的菌落。在麦康凯培养基上不生长。API20NE生化实验表明该菌株不水解明胶尿素和七叶苷。不同化葡萄糖、柠檬酸、苯乙酸、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄酸盐、癸酸、己二酸。硝酸盐还原呈阴性。非发酵菌实验表明该菌株与精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、枸橼酸盐、尿素、七叶苷、木糖、氧化酶等反应呈阳性。与硫化氢、葡萄糖、ONPG、蔗糖、麦芽糖、硝酸盐还原、蛋白胨水的反应呈阴性。对该菌株进行了全基因组序列的测定,经序列拼接,得到一条完整的基因组序列,该基因组长度为549960 bp, G+C含量为45.87%。基于16S rRNA系统进化树的构建。结果表明该分离株处于莫拉氏菌属的进化分支内,与兔莫拉氏菌、多动物莫拉氏菌同源性较高。最后为测定该菌株与莫拉氏菌属种内的其它细菌的亲缘关系,本研究以该菌株的全基因组序列为研究对象,进行了平均核苷酸同源性分析。结果发现该菌株的全基因组与莫拉氏菌属种内细菌的全基因组对比得到ANIb值的范围为69.23%～74.21%, ANIm值的范围为84.02%-87.16%。该菌株的甲基萘醌组分为MK-7 (92%)、MK-6 (5%)和MK-8(2%)。菌株极性脂为diphosphatidyl(DPG)、phosphatidyl ethanolamine(PE)、glycolipid(GL)、 unidentified phospholipids(UPL)和undentified aminophospholipids(UAPL)。基于以上这些多相性分析结果,建议将该菌株界定为莫拉氏菌属的一个新种,并命名为Moraxellaanas.sp.nov (RCAD00137)。为了解该分离菌株是否对鸭有致病性,本研究进行了雏鸭攻毒实验,结果表明该菌对健康雏鸭不致死。小鼠攻毒试验表明该菌对小鼠不致死。此外,鸭胚感染实验结果发现该菌株对鸭胚不致死。采用K-B药敏纸片扩散法进行药敏试验,结果表明该分离菌株对青霉素G、氨苄西林、庆大霉素、氟苯尼考、萘啶酸、环丙沙星、恩诺沙星、克林霉素、红霉素螺旋霉素、阿奇霉素、新诺明、复方新诺明、氯霉素、利福平等抗生素耐药。对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶等抗生素敏感。该菌株表现出多重耐药的现象。运用14种抗生素进行最小抑菌浓度的测定,结果菌株对喹诺酮类药物的最小抑菌浓度均在512μg/ml以上,表现出高度耐药。对临床上常用的林可霉类中的林可霉素、克林霉素以及大环内脂类的阿奇霉素和氨曲南、磺胺甲基异恶唑的最小抑菌浓度值均在512μg/ml以上,同样表现出了高度耐药。而对氯霉素(8μg/ml)、羧苄西林(16μg/ml)、万古霉素(1μg/ml)则表现低水平的耐药。
【关键词】：鸭莫拉氏菌新种 分离鉴定 生化试验 16SrRNA 平均核苷酸同源性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-11
• 1 文献综述11-19
• 1.1 莫拉氏菌病原学12-16
• 1.2 细菌新种的分离鉴定16-17
• 1.3 平均核苷酸同源性(ANI)17-19
• 1.4 研究的目的及意义19
• 2 实验材料和方法19-27
• 2.1 实验材料19-20
• 2.2 实验方法20-26
• 2.3 动物感染实验26
• 2.4 鸭胚感染实验26-27
• 2.5 基于全基因组的平均核苷酸同源性分析27
• 3 实验结果27-44
• 3.1 16S rDNA基因扩增27-28
• 3.2 16S rRNA基因扩增28-29
• 3.3 选择性培养结果29-30
• 3.4 形态学检查30-32
• 3.4.1 革兰氏染色30-31
• 3.4.2 黑斯荚膜染色31-32
• 3.5 生化试验32-33
• 3.5.1 API 20 NE鉴定结果32-33
• 3.5.2 非发酵菌生化鉴定管试验33
• 3.6 药物敏感性的测定33-35
• 3.7 最小抑菌浓度的测定35-36
• 3.8 醌组分及极性脂的测定36-37
• 3.9 全基因组的提取及测序37-44
• 3.9.1 基于16S rRNA基因序列分析及系统发育树的构建38-41
• 3.9.2 生长曲线的测定41-43
• 3.9.3 动物感染试验43
• 3.9.4 鸭胚感染试验43
• 3.9.5 平均核苷酸同源性分析43-44
• 4 讨论44-53
• 4.1 RCAD00137菌株的鉴定44
• 4.2 RCAD00137菌株的特性44-48
• 4.3 RCAD00137菌株药物敏感性测定48-50
• 4.4 RCAD00137菌株醌组分测定以及极性脂测定50
• 4.5 RCAD00137菌株的致病性50-51
• 4.6 基于全基因组RCAD00137菌株平均核苷酸同源性分析51-53
• 5 结论53-54
• 6 参考文献54-62
• 致谢62

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本文编号：298446