牛轮状病毒和牛冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2021-01-20 20:55

　　为建立一种同时检测牛轮状病毒（BRV）和牛冠状病毒（BCV）的方法,本研究根据GenBank中登录的BRV VP6基因保守序列和BCV N基因保守序列设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测BRV和BCV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。该方法与牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、牛肠道病毒、牛传染性鼻气管炎病毒均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对BRV和BCV重组质粒标准品的最低检测限分别为41.8拷贝/μL和3.55拷贝/μL,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。利用建立的该方法对本实验室于2019年3月～9月在河北省内采集的72份牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BRV的阳性率为50.0%（36/72）,BCV的阳性率为75.0%（54/72）,BRV和BCV共感染率为33.3%（24/72）;而常规PCR的上述检测结果分别为47.2%（34/72）、70.8%（51/72）,共感染率为29.1%（22/72）,二者对BRV和BCV检测结果的阳性符合率分别为97.2%、96.8%,表明该方法可以用于临床样品的检测。本研究建... 

【文章来源】：中国预防兽医学报. 2020,42(10)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

荧光定量PCR的特异性试验结果

将BRV和BCV重组质粒标准品稀释成1.0×107拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL后，经双重Taq Man荧光定量PCR检测其敏感性。结果显示，BRV和BCV的重组质粒标准品最低检测限分别为4.18×101拷贝/μL和3.55×100拷贝/μL（图4）；而常规PCR对BRV重组质粒标准品最低检测限为4.18×104拷贝/μL，对BCV重组质粒标准品的检出最低限为3.55×103拷贝/μL（图5）。表明该方法敏感性优于常规PCR，敏感性较高。2.5 重复性试验结果

将BRV和BCV病毒核酸作为模板，利用BRV-F/BRV-R和BCV-F/BCV-R PCR扩增后，分别在116 bp和139 bp出现和预期相符的目的条带（图1）。PCR产物纯化回收后克隆至p MD19-T载体，构建重组质粒p MD-BRV和p MD-BCV，测序结果显示插入片段与预期一致，表明正确构建了重组质粒标准品。经计算p MD-BRV和p MD-BCV的拷贝数分别为4.36×1010拷贝/μL和3.55×1010拷贝/μL。2.2 双重荧光定量PCR反应条件的优化结果及标准曲线的建立

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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[2]BRV与BCoV SYBR Green I RT-qPCR检测方法的建立及应用[D]. 曹禹.黑龙江八一农垦大学 2018
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本文编号：2989771