河南HN12株鸡传染性法氏囊病病毒生物学特性研究
发布时间：2021-01-24 12:31
鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的,主要侵害雏鸡免疫器官的一种急性、接触性、免疫抑制性病毒传染病。IBDV感染鸡群可造成鸡群发病死亡、生产性能下降,尤其80年代以来vvlBDV的出现,使鸡群出现70%-100%的死亡率,造成直接的经济损失。传染性法氏囊病病毒可引起雏鸡免疫抑制性疾病,使雏鸡免疫机能低下,降低对其他疫苗免疫应答效力,增强对其他疫病的易感性,增加并发或继发感染其它疾病的几率,造成间接的损失。RNA病毒的RNA聚合酶高变区的高突变率导致IBDV抗原变异株和致弱毒株的出现,他们可能是近年来IBD免疫后疫病频发的一个重要原因之一。本病对于养禽业存在很大的危害,受到国内外养殖业的普遍高度重视。河南省动物性食品安全重点实验室从2011年1月到2012年12月从河南郑州、洛阳、焦作、濮阳等地市共分离毒株35份,引起病变特征比较明显和实验室诊断结果比较确切的共有12份,从中选取4个分离株为重点研究对象,将分离自河南郑州登封的鸡传染性法氏囊病病毒其命名为HN12分离株。以HN12株为代表采用常规方法和分子生物学方法进行系统研究。该毒株经过鸡只发病特性、剖检变化、实验室常规检测方法...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
缩略语英汉对照表
摘要
文献综述
1 鸡传染性法氏囊病概述
2 IBDV的历史简介
3 IBDV病原学研究进展
3.1 IBDV的生物学特性
3.1.1 病毒的分类及形态结构
3.1.2 病毒的理化性质
3.1.3 病毒的增殖特性
3.1.4 病毒的抗原性
3.2 IBDV的分子生物学特性
3.2.1 病毒基因组的结构特性
3.2.2 病毒蛋白结构与作用
4. IBDV的致病机制及毒力的分子基础
4.1 IBDV的致病性研究
4.2 IBDV的毒力变异
4.3 VP2和毒力间的关系
5 IBDV的流行病学
6 IBDV的诊断方法与技术
6.1 病毒的分离鉴定
6.2 血清学诊断方法
6.2.1 琼脂免疫扩散试验
6.2.2 病毒血清中和试验
6.2.3 酶联免疫吸附试验
6.2.4 其他免疫学诊断方法
6.3 分子生物学诊断技术
7 IBDV的细胞培养技术
7.1 动物细胞培养的起源
7.2 动物细胞培养的方法
7.2.1 贴壁培养
7.2.2 悬浮培养
7.3 IBDV适应增殖的细胞
引言
试验一 鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器
1.1.2 SPF鸡胚及SPF鸡
1.1.3 IBDV抗原和标准阳性血清
1.2 方法
1.2.1 病料来源
1.2.2 病料处理
1.2.3 琼脂免疫扩散试验（AGID）
1.2.4回归易感鸡试验
1.2.5 病毒在SPF鸡胚上的分离培养
1.2.6 分离株毒力测定
1.2.7 引物合成
1.2.8 RT-PCR扩增鉴定
2 结果
2.1 琼脂免疫扩散试验（AGID）
2.2 动物回归试验
2.3 病毒在SPF鸡胚上传代结果
2.4 IBDV分离株毒力测定
2.4.1 SPF鸡只发病情况及剖检变化
2.4.2 SPF鸡只发病率及死亡率
2.4.3 SPF鸡胚病变
50的测定"> 2.4.4 分离株ELD50的测定
2.5 PCR检测结果
3 结论
4 讨论
试验二 分离株细胞驯化培养及特性研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
1.1.2 耗材
1.1.3 主要试剂及配制
1.1.4 细胞与毒株
1.2 方法
1.2.1 DF-I细胞培养
1.2.2 IBDVHN12株在DF-1细胞上培养条件优化
1.2.3 IBDV细胞适应毒株毒力测定
1.2.4 细胞适应毒株的理化特性
2 结果与分析
2.1 IBDV在DF-1细胞上培养条件优化
2.1.1 细胞生长曲线
2.1.2 IBDV最佳接毒量的确定
2.1.3 IBDV接种细胞吸附时间的确定结果
2.1.4 血清浓度对IBDV增殖的影响
2.2 细胞适应毒株AGID检测
2.3 细胞适应毒株毒力
2.3.1 DF-1细胞病变
2.3.2 TCIDso测定
2.4 IBDV细胞适应毒株的理化试验结果
2.4.1 病毒的凝集试验结果
2.4.2 有机溶剂试验和耐酸碱性试验
2.4.3 耐热性试验结果表明
3 结论
4 讨论
试验三 分离株原毒、鸡胚毒和细胞毒VP2的克隆及序列分析
l材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
1.1.2 毒株
1.1.3 菌株及载体
1.1.4 主要生物学试剂
1.1.5 试剂配制
1.2 方法
1.2.1 病料的处理
1.2.2 引物设计及合成
1.2.3 病毒RNA的提取
1.2.4 反转录PCR（RT-PCR）扩增
1.2.5 1%琼脂糖凝胶电泳
1.2.6 PCR产物的回收与纯化
1.2.7 重组克隆质粒的构建
1.2.8 重组质粒的鉴定
1.2.9 3株不同IBDV适应毒株核苷酸序列测定及序列分析
1.2.10 各适应毒株系统进化树分析
1.2.11 各适应毒株2级结构比较分析
2 结果与分析
2.0 IBDV不同适应毒株VP2的RT-PCR扩增结果
2.1 IBDV不同适应毒株VP2基因片段PCR产物纯化结果
2.2 重组质粒的酶切鉴定及测序鉴定
2.3 IBDVVP2基因片段的测序及序列分析
2.3.1 3株IBDVVP2间基因片段及推导的氨基酸比较分析
2.3.2 各适应毒株同源性比较分析
2.3.3 系统进化树分析
2.3.4 3株IBDV适应毒株VP2基因2级结构比较分析
3 结论
4 讨论
试验四 分离株囊毒、胚毒和细胞毒对SPF鸡免疫效果实验
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株
1.1.2 种蛋及SPF鸡
1.1.3 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 病毒准备
1.2.2 病毒毒力测定
1.2.3 不同毒株灭活免疫乳化剂的制备
1.2.4 安全性检验
1.2.5 效力检验
1.2.6 血清AGID滴度检测
1.2.7 血清中和试验
1.2.8 免疫保护试验
2 结果
2.1 病毒毒力测定
50测定"> 2.1.1 HN12B1毒株ELD50测定
50测定"> 2.1.2 HN12E4毒株ELD50测定
50测定"> 2.1.3 HN12C8毒株TCID50测定
2.2 安全试验
2.3 血清AGID滴度测定
2.4 中和试验结果
2.5 免疫保护试验
3 结论与讨论
全文总结
参考文献
附录一：VP2推导氨基酸序列对比
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定[J]. 张晋强,牛丽,宋美琴,白喜云. 山西农业大学学报(自然科学版). 2011(04)
[2]基于不同引物的RT-PCR检测IBDV敏感性的比较[J]. 王艳,李树清,孙建和,汪振兴,陈志飞,张强,王巧全,严亚贤. 中国动物检疫. 2010(03)
[3]鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建[J]. 秦立廷,祁小乐,高玉龙,高宏雷,步志高,王笑梅. 微生物学报. 2008(12)
[4]鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 曹永萍,曹光伟. 中国畜牧兽医. 2008(11)
[5]兽医传染病学学科发展现状与展望[J]. 陈焕春,周锐,肖少波,何启盖,宋云峰. 中国家禽. 2008(11)
[6]传染性法氏囊病及其病原分子生物学研究进展[J]. 何秀苗,阳秀英,韦平. 动物医学进展. 2007(02)
[7]鸡传染性法氏囊病间接ELISA抗体检测试剂盒的研制[J]. 马飞. 上海畜牧兽医通讯. 2005(06)
[8]鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱株基因组B节段的克隆和序列分析[J]. 包晓玮,张厚双,高宏雷,付朝阳,彭志伟,单文鲁,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2005(02)
[9]IBDV强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞的凋亡及调控机制[J]. 刘玉锋,佘锐萍,李慧姣,梁明珍,彭芳珍. 中国农业大学学报. 2004(03)
[10]传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒的构建与表达[J]. 蒋静,孙建和,陆苹. 华中农业大学学报. 2004(02)
本文编号：2997252
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
缩略语英汉对照表
摘要
文献综述
1 鸡传染性法氏囊病概述
2 IBDV的历史简介
3 IBDV病原学研究进展
3.1 IBDV的生物学特性
3.1.1 病毒的分类及形态结构
3.1.2 病毒的理化性质
3.1.3 病毒的增殖特性
3.1.4 病毒的抗原性
3.2 IBDV的分子生物学特性
3.2.1 病毒基因组的结构特性
3.2.2 病毒蛋白结构与作用
4. IBDV的致病机制及毒力的分子基础
4.1 IBDV的致病性研究
4.2 IBDV的毒力变异
4.3 VP2和毒力间的关系
5 IBDV的流行病学
6 IBDV的诊断方法与技术
6.1 病毒的分离鉴定
6.2 血清学诊断方法
6.2.1 琼脂免疫扩散试验
6.2.2 病毒血清中和试验
6.2.3 酶联免疫吸附试验
6.2.4 其他免疫学诊断方法
6.3 分子生物学诊断技术
7 IBDV的细胞培养技术
7.1 动物细胞培养的起源
7.2 动物细胞培养的方法
7.2.1 贴壁培养
7.2.2 悬浮培养
7.3 IBDV适应增殖的细胞
引言
试验一 鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器
1.1.2 SPF鸡胚及SPF鸡
1.1.3 IBDV抗原和标准阳性血清
1.2 方法
1.2.1 病料来源
1.2.2 病料处理
1.2.3 琼脂免疫扩散试验（AGID）
1.2.4回归易感鸡试验
1.2.5 病毒在SPF鸡胚上的分离培养
1.2.6 分离株毒力测定
1.2.7 引物合成
1.2.8 RT-PCR扩增鉴定
2 结果
2.1 琼脂免疫扩散试验（AGID）
2.2 动物回归试验
2.3 病毒在SPF鸡胚上传代结果
2.4 IBDV分离株毒力测定
2.4.1 SPF鸡只发病情况及剖检变化
2.4.2 SPF鸡只发病率及死亡率
2.4.3 SPF鸡胚病变
50的测定"> 2.4.4 分离株ELD50的测定
2.5 PCR检测结果
3 结论
4 讨论
试验二 分离株细胞驯化培养及特性研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
1.1.2 耗材
1.1.3 主要试剂及配制
1.1.4 细胞与毒株
1.2 方法
1.2.1 DF-I细胞培养
1.2.2 IBDVHN12株在DF-1细胞上培养条件优化
1.2.3 IBDV细胞适应毒株毒力测定
1.2.4 细胞适应毒株的理化特性
2 结果与分析
2.1 IBDV在DF-1细胞上培养条件优化
2.1.1 细胞生长曲线
2.1.2 IBDV最佳接毒量的确定
2.1.3 IBDV接种细胞吸附时间的确定结果
2.1.4 血清浓度对IBDV增殖的影响
2.2 细胞适应毒株AGID检测
2.3 细胞适应毒株毒力
2.3.1 DF-1细胞病变
2.3.2 TCIDso测定
2.4 IBDV细胞适应毒株的理化试验结果
2.4.1 病毒的凝集试验结果
2.4.2 有机溶剂试验和耐酸碱性试验
2.4.3 耐热性试验结果表明
3 结论
4 讨论
试验三 分离株原毒、鸡胚毒和细胞毒VP2的克隆及序列分析
l材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
1.1.2 毒株
1.1.3 菌株及载体
1.1.4 主要生物学试剂
1.1.5 试剂配制
1.2 方法
1.2.1 病料的处理
1.2.2 引物设计及合成
1.2.3 病毒RNA的提取
1.2.4 反转录PCR（RT-PCR）扩增
1.2.5 1%琼脂糖凝胶电泳
1.2.6 PCR产物的回收与纯化
1.2.7 重组克隆质粒的构建
1.2.8 重组质粒的鉴定
1.2.9 3株不同IBDV适应毒株核苷酸序列测定及序列分析
1.2.10 各适应毒株系统进化树分析
1.2.11 各适应毒株2级结构比较分析
2 结果与分析
2.0 IBDV不同适应毒株VP2的RT-PCR扩增结果
2.1 IBDV不同适应毒株VP2基因片段PCR产物纯化结果
2.2 重组质粒的酶切鉴定及测序鉴定
2.3 IBDVVP2基因片段的测序及序列分析
2.3.1 3株IBDVVP2间基因片段及推导的氨基酸比较分析
2.3.2 各适应毒株同源性比较分析
2.3.3 系统进化树分析
2.3.4 3株IBDV适应毒株VP2基因2级结构比较分析
3 结论
4 讨论
试验四 分离株囊毒、胚毒和细胞毒对SPF鸡免疫效果实验
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株
1.1.2 种蛋及SPF鸡
1.1.3 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 病毒准备
1.2.2 病毒毒力测定
1.2.3 不同毒株灭活免疫乳化剂的制备
1.2.4 安全性检验
1.2.5 效力检验
1.2.6 血清AGID滴度检测
1.2.7 血清中和试验
1.2.8 免疫保护试验
2 结果
2.1 病毒毒力测定
50测定"> 2.1.1 HN12B1毒株ELD50测定
50测定"> 2.1.2 HN12E4毒株ELD50测定
50测定"> 2.1.3 HN12C8毒株TCID50测定
2.2 安全试验
2.3 血清AGID滴度测定
2.4 中和试验结果
2.5 免疫保护试验
3 结论与讨论
全文总结
参考文献
附录一：VP2推导氨基酸序列对比
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定[J]. 张晋强,牛丽,宋美琴,白喜云. 山西农业大学学报(自然科学版). 2011(04)
[2]基于不同引物的RT-PCR检测IBDV敏感性的比较[J]. 王艳,李树清,孙建和,汪振兴,陈志飞,张强,王巧全,严亚贤. 中国动物检疫. 2010(03)
[3]鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建[J]. 秦立廷,祁小乐,高玉龙,高宏雷,步志高,王笑梅. 微生物学报. 2008(12)
[4]鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 曹永萍,曹光伟. 中国畜牧兽医. 2008(11)
[5]兽医传染病学学科发展现状与展望[J]. 陈焕春,周锐,肖少波,何启盖,宋云峰. 中国家禽. 2008(11)
[6]传染性法氏囊病及其病原分子生物学研究进展[J]. 何秀苗,阳秀英,韦平. 动物医学进展. 2007(02)
[7]鸡传染性法氏囊病间接ELISA抗体检测试剂盒的研制[J]. 马飞. 上海畜牧兽医通讯. 2005(06)
[8]鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱株基因组B节段的克隆和序列分析[J]. 包晓玮,张厚双,高宏雷,付朝阳,彭志伟,单文鲁,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2005(02)
[9]IBDV强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞的凋亡及调控机制[J]. 刘玉锋,佘锐萍,李慧姣,梁明珍,彭芳珍. 中国农业大学学报. 2004(03)
[10]传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒的构建与表达[J]. 蒋静,孙建和,陆苹. 华中农业大学学报. 2004(02)
本文编号：2997252
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2997252.html
