猪流行性腹泻病毒BD株的分离鉴定及稳定表达pAPN基因Vero细胞系的构建
发布时间：2021-01-26 09:53
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是引起猪以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪死亡率达95%以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，在世界各地广泛传播，造成巨大的经济损失。因此，PED的及时确诊和防治研究具有重要的意义。本试验首先将经RT-PCR鉴定为PEDV阳性的腹泻仔猪粪便，小肠及内容物样品，在Vero细胞上连续传代，分离病毒，并通过稳定的细胞病变、病毒的TCID50测定、RT-PCR扩增试验、IPMA、间接ELISA试验等方法对该分离毒进行了鉴定，并进行连续传代。试验结果表明：病毒盲传22代，未出现明显的病变，第23代48h出现可见CPE。为进一步证明这种病变是由PEDV所引起的，本试验采用RT-PCR技术扩增PEDV S基因，结果为阳性；单层过氧化物酶试验细胞胞浆中出现弥漫状棕色着染，说明细胞感染PEDV；间接ELISA检测，判断此细胞培养毒为阳性；对第23代病毒测定TCID50结果为10-2.5/0.05ml。由以上的试验可以证明从粪便里分离出的这株病毒为PEDV，此毒株的获得为我国研...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
1.1 PEDV 概述
1.2 猪流行性腹泻病毒的生物学特性研究
1.2.1 PEDV 的形态结构
1.2.2 PEDV 的理化特性
1.3 PEDV 基因组结构及主要编码的蛋白
1.3.1 PEDV 的基因组结构
1.3.2 主要编码的蛋白
1.4 PEDV 的培养特性
1.5 病毒感染的分子基础与病毒感染特性的研究
1.6 本试验研究的理论意义
2.材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
2.1.2 细胞系
2.1.3 菌株与载体
2.1.4 试验中用到的引物
2.1.5 抗体及血清
2.1.6 主要试剂及配制
2.1.7 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 样品的采集
2.2.2 样品的处理
2.2.3 病毒的分离培养
2.2.4 分离病毒的鉴定
2.2.5 pAPN 全基因的扩增、克隆及鉴定
2.2.6 pAPN-SPC 基因的 PCR 扩增
2.2.7 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 的构建及提取
2.2.8 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 的鉴定及序列测定
2.2.9 G418 最佳工作浓度的确定
2.2.10 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 转染 Vero 细胞及筛选重组质粒
2.2.11 pAPN-SPC 在 Vero 细胞系中表达的检测
2.2.12 通过荧光定量 PCR 检测构建细胞对 PEDV 的易感性
3 结果与分析
3.1 结果
3.1.1 分离病毒培养结果
3.1.2 分离病毒鉴定结果
3.1.3 pAPN-SPC-Vero 细胞系鉴定结果
3.2 分析
3.2.1 病毒的分离鉴定
3.2.2 pAPN-Vero 细胞系的建立
4 结论
参考文献
在读期间发表的论文
附录
附录 A pAPN 基因测序结果
作者简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻的研究进展[J]. 陈刚,李伟,张阳,吴昊,施慈,任晓峰,赵凯. 世界华人消化杂志. 2013(01)
[2]猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定[J]. 单智夫,唐丽杰,乔薪媛,葛俊伟,李一经. 东北农业大学学报. 2012(09)
[3]猪流行性腹泻诊断方法的研究进展[J]. 喻明成,甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[4]猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J]. 李思银,杨亮宇,杨玉艾. 猪业科学. 2010(12)
[5]猪流行性腹泻的实验室诊断方法研究进展[J]. 刘涛,王瑞. 猪业科学. 2010(12)
[6]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性[J]. 毛雅元,张桂红,葛俊伟,姜艳平,乔薪瑗,崔文,李一经. 病毒学报. 2010(06)
[7]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[8]颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达[J]. 何永林,朱道银,伊正君,杨春,徐蕾,王瑜伟. 中国生物制品学杂志. 2008(12)
[9]应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 王建超,周燕,华平,邹勇,谭文松,钱永清. 畜牧兽医学报. 2003(06)
[10]猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的适应性试验[J]. 李品齐,丁敦志,刘万钧. 中国兽医杂志. 1997(09)
本文编号：3000902
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
1.1 PEDV 概述
1.2 猪流行性腹泻病毒的生物学特性研究
1.2.1 PEDV 的形态结构
1.2.2 PEDV 的理化特性
1.3 PEDV 基因组结构及主要编码的蛋白
1.3.1 PEDV 的基因组结构
1.3.2 主要编码的蛋白
1.4 PEDV 的培养特性
1.5 病毒感染的分子基础与病毒感染特性的研究
1.6 本试验研究的理论意义
2.材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
2.1.2 细胞系
2.1.3 菌株与载体
2.1.4 试验中用到的引物
2.1.5 抗体及血清
2.1.6 主要试剂及配制
2.1.7 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 样品的采集
2.2.2 样品的处理
2.2.3 病毒的分离培养
2.2.4 分离病毒的鉴定
2.2.5 pAPN 全基因的扩增、克隆及鉴定
2.2.6 pAPN-SPC 基因的 PCR 扩增
2.2.7 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 的构建及提取
2.2.8 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 的鉴定及序列测定
2.2.9 G418 最佳工作浓度的确定
2.2.10 重组真核表达载体 pEGFP-pAPN-SPC 转染 Vero 细胞及筛选重组质粒
2.2.11 pAPN-SPC 在 Vero 细胞系中表达的检测
2.2.12 通过荧光定量 PCR 检测构建细胞对 PEDV 的易感性
3 结果与分析
3.1 结果
3.1.1 分离病毒培养结果
3.1.2 分离病毒鉴定结果
3.1.3 pAPN-SPC-Vero 细胞系鉴定结果
3.2 分析
3.2.1 病毒的分离鉴定
3.2.2 pAPN-Vero 细胞系的建立
4 结论
参考文献
在读期间发表的论文
附录
附录 A pAPN 基因测序结果
作者简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻的研究进展[J]. 陈刚,李伟,张阳,吴昊,施慈,任晓峰,赵凯. 世界华人消化杂志. 2013(01)
[2]猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定[J]. 单智夫,唐丽杰,乔薪媛,葛俊伟,李一经. 东北农业大学学报. 2012(09)
[3]猪流行性腹泻诊断方法的研究进展[J]. 喻明成,甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[4]猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J]. 李思银,杨亮宇,杨玉艾. 猪业科学. 2010(12)
[5]猪流行性腹泻的实验室诊断方法研究进展[J]. 刘涛,王瑞. 猪业科学. 2010(12)
[6]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性[J]. 毛雅元,张桂红,葛俊伟,姜艳平,乔薪瑗,崔文,李一经. 病毒学报. 2010(06)
[7]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[8]颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达[J]. 何永林,朱道银,伊正君,杨春,徐蕾,王瑜伟. 中国生物制品学杂志. 2008(12)
[9]应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 王建超,周燕,华平,邹勇,谭文松,钱永清. 畜牧兽医学报. 2003(06)
[10]猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的适应性试验[J]. 李品齐,丁敦志,刘万钧. 中国兽医杂志. 1997(09)
本文编号：3000902
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