利用细胞穿膜肽进行精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的初步探索
发布时间：2021-01-27 14:25
Sohlh2（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix2）是bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子超家族的成员,是启动原始卵泡发育的关键基因之一,制备转有Sohlh2基因的动物具有重要的科研价值和应用价值。而在制备转基因动物的方法中,精子载体法以操作简单,人为机械损伤较少的优点,受广大研究者的瞩目。与此同时,精子载体法阳性率不高的问题得不到妥善解决,需要在精子载体法的基础上提高外源基因进入精子的效率,以达到提高阳性率的目的,细胞穿膜肽就是一种较好的解决方案。穿膜肽是由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽,具有很强的跨膜转运能力。本研究拟比较细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）用于不同细胞转染的转染效率,之后探讨将筛选的CPPs用于精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的可行性。具体研究结果如下。1.Sohlh2基因全长编码区序列片段的克隆。基因包含全长编码序列的扩增片段大小为1281bp,应用MEGA和ORF Finder等程序对所得序列...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 综述文献
1. Sohlh2基因的生理功能
2. 转基因动物生产制备研究进展
2.1 反转录病毒感染法
2.2 显微注射法
2.3 胚胎干细胞法
2.4 体细胞核移植法
2.5 精子载体法
3. 精子捕获并内化外源DNA的分子机制,SMGT的影响因素及存在问题
3.1 SMGT精子捕获并内化外源DNA的分子机制
3.2 外源DNA对SMGT的效率影响
3.3 精子质量对SMGT的效率影响
3.4 精子与外源基因孵育时间、温度及混合比例对SMGT效率的影响
3.5 孵育溶液中的电荷密度对SMGT效率的影响
3.6 SMGT存在的问题
4. 细胞穿膜肽的定义以及研究进展
4.1 细胞穿膜肽的结构特点以及分类
4.2 细胞穿膜肽与外源物质的连接方式
4.3 细胞穿膜肽的穿膜机制
5. 研究的目的和意义
第二章 水牛Sohlh2基因克隆及生物信息学分析
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验方法
2 试验结果
2.1 总RNA的提取
2.2 克隆得到的水牛Sohlh2基因
2.3 水牛Sohlh2基因pMD18-T重组质粒克隆及鉴定
2.4 序列提交
2.5 Sohlh2基因生物信息学分析
3 分析与讨论
3.1 水牛Sohlh2基因的克隆
3.2 水牛Sohlh2基因的生物信息学分析
4 结论
第三章 水牛Sohlh2基因表达模式的研究
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验方法
2 试验结果
2.1 定量引物验证
2.2 Sohlh2基因在水牛组织中表达模式的建立
2.3 Sohlh2基因真核表达载体及慢病毒载体的构建
2.4 慢病毒包装及滴度测定
3 分析和讨论
3.1 Sohlh2基因在不同组织的mRNA表达
3.2 构建Sohlh2基因的慢病毒载体
4 结论
第四章 穿膜肽在不同细胞及精子上的转染效率
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 试验方法
2 实验结果
2.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响
2.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率
2.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响
3 分析讨论
3.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响
3.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率
3.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响
4 结论
第五章 利用穿膜肽和慢病毒进行IVF制备转Sohlh2基因猪胚胎
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 试验方法
2 实验结果
2.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）影响
2.2 不同载体（慢病毒和穿膜肽C105y）对转Sohlh2基因猪胚胎发育的影响
3 分析与讨论
3.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）影响
3.2 不同载体（慢病毒和穿膜肽C105y）对转Sohlh基因猪胚胎发育的影响
4 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞穿透肽的研究进展[J]. 李凤英,何京,钟海军. 中国新药杂志. 2013(15)
[2]细胞穿膜肽的研究进展[J]. 孙春萌,沈雁,涂家生. 中国药学杂志. 2013(14)
[3]精子与慢病毒共孵育法制备转基因猪的检测[J]. 周均云,习欠云,蔡伟光,高萍,朱晓彤,束刚,王丽娜,王松波,江青艳,张永亮. 畜牧与兽医. 2012(S1)
[4]精子载体法制备转基因动物的研究进展[J]. 杜伟,崔海信,王琰,孙长娇,赵翔. 生物技术通报. 2012(12)
[5]细胞穿透肽介导外源物质入胞转运研究进度[J]. 付爱玲,赵宝全,陈亨宇,战丽萍. 国际药学研究杂志. 2012(02)
[6]狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定[J]. 房丽君,黄世威,王颖,刘晔,张守峰,扈荣良. 中国生物制品学杂志. 2011(02)
[7]EGFP基因在不同细胞中的转染效率[J]. 徐贵江,张明,任丽伟,洪菊生,李国庆. 中国医药指南. 2010(32)
[8]精子载体法转基因技术研究进展[J]. 路立里,郝耿,於建国,马帧,杨会国. 中国畜牧兽医. 2010(09)
[9]精子介导法制备GHRH转基因猪的研究[J]. 丁景华,吴珍芳,习欠云,刘小龙,蔡伟光,孟繁民,束刚,王松波,江青艳,张永亮. 中国兽医学报. 2010(05)
[10]不同品种公猪精子活率及运动能力的比较[J]. 伏彭辉,张家庆,毛献宝,范晓明,蒋如明. 黑龙江畜牧兽医. 2010(05)
博士论文
[1]水牛诱导多能干细胞的研究[D]. 邓彦飞.广西大学 2012
硕士论文
[1]公猪精液在不同温度下保存和稀释剂添加不同添加剂保存公猪精液后的一些生理生化变化[D]. 陈东峰.广西大学 2013
[2]精子载体法介导生产牛转基因胚胎的初步研究[D]. 刘荣立.广西大学 2013
[3]Bmp4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制[D]. 丁祥云.山东大学 2013
[4]Bmp4/Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用及其机制研究[D]. 李毅.山东大学 2012
[5]狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及免疫试验[D]. 房丽君.吉林大学 2011
[6]利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究[D]. 孙克宁.河南农业大学 2011
[7]猪精子介导基因转移技术优化研究[D]. 周辉云.扬州大学 2011
[8]二甲基亚砜（DMSO）增强细胞膜穿透肽TAT穿膜效率的实验研究[D]. 王琥.三峡大学 2010
[9]蜂毒短肽疏水性尾部增加阳离子聚合物的基因转染效率及其在siRNA转染中的应用[D]. 王颖丽.中国人民解放军军事医学科学院 2008
[10]穿膜肽介导的新型基因转运载体的研究[D]. 张宏达.中国人民解放军军事医学科学院 2008
本文编号：3003206
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 综述文献
1. Sohlh2基因的生理功能
2. 转基因动物生产制备研究进展
2.1 反转录病毒感染法
2.2 显微注射法
2.3 胚胎干细胞法
2.4 体细胞核移植法
2.5 精子载体法
3. 精子捕获并内化外源DNA的分子机制,SMGT的影响因素及存在问题
3.1 SMGT精子捕获并内化外源DNA的分子机制
3.2 外源DNA对SMGT的效率影响
3.3 精子质量对SMGT的效率影响
3.4 精子与外源基因孵育时间、温度及混合比例对SMGT效率的影响
3.5 孵育溶液中的电荷密度对SMGT效率的影响
3.6 SMGT存在的问题
4. 细胞穿膜肽的定义以及研究进展
4.1 细胞穿膜肽的结构特点以及分类
4.2 细胞穿膜肽与外源物质的连接方式
4.3 细胞穿膜肽的穿膜机制
5. 研究的目的和意义
第二章 水牛Sohlh2基因克隆及生物信息学分析
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验方法
2 试验结果
2.1 总RNA的提取
2.2 克隆得到的水牛Sohlh2基因
2.3 水牛Sohlh2基因pMD18-T重组质粒克隆及鉴定
2.4 序列提交
2.5 Sohlh2基因生物信息学分析
3 分析与讨论
3.1 水牛Sohlh2基因的克隆
3.2 水牛Sohlh2基因的生物信息学分析
4 结论
第三章 水牛Sohlh2基因表达模式的研究
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
1.2 试验方法
2 试验结果
2.1 定量引物验证
2.2 Sohlh2基因在水牛组织中表达模式的建立
2.3 Sohlh2基因真核表达载体及慢病毒载体的构建
2.4 慢病毒包装及滴度测定
3 分析和讨论
3.1 Sohlh2基因在不同组织的mRNA表达
3.2 构建Sohlh2基因的慢病毒载体
4 结论
第四章 穿膜肽在不同细胞及精子上的转染效率
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 试验方法
2 实验结果
2.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响
2.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率
2.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响
3 分析讨论
3.1 探讨C105y和Sohlh2基因质粒孵育条件及不同细胞类型对五种穿膜肽转染效果的影响
3.2 流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率
3.3 穿膜肽与探针fam在不同孵育液和孵育温度下对猪精子转染效果的影响
4 结论
第五章 利用穿膜肽和慢病毒进行IVF制备转Sohlh2基因猪胚胎
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 试验方法
2 实验结果
2.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）影响
2.2 不同载体（慢病毒和穿膜肽C105y）对转Sohlh2基因猪胚胎发育的影响
3 分析与讨论
3.1 不同方式处理精子对精子活率、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）和前向性（STR）影响
3.2 不同载体（慢病毒和穿膜肽C105y）对转Sohlh基因猪胚胎发育的影响
4 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞穿透肽的研究进展[J]. 李凤英,何京,钟海军. 中国新药杂志. 2013(15)
[2]细胞穿膜肽的研究进展[J]. 孙春萌,沈雁,涂家生. 中国药学杂志. 2013(14)
[3]精子与慢病毒共孵育法制备转基因猪的检测[J]. 周均云,习欠云,蔡伟光,高萍,朱晓彤,束刚,王丽娜,王松波,江青艳,张永亮. 畜牧与兽医. 2012(S1)
[4]精子载体法制备转基因动物的研究进展[J]. 杜伟,崔海信,王琰,孙长娇,赵翔. 生物技术通报. 2012(12)
[5]细胞穿透肽介导外源物质入胞转运研究进度[J]. 付爱玲,赵宝全,陈亨宇,战丽萍. 国际药学研究杂志. 2012(02)
[6]狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定[J]. 房丽君,黄世威,王颖,刘晔,张守峰,扈荣良. 中国生物制品学杂志. 2011(02)
[7]EGFP基因在不同细胞中的转染效率[J]. 徐贵江,张明,任丽伟,洪菊生,李国庆. 中国医药指南. 2010(32)
[8]精子载体法转基因技术研究进展[J]. 路立里,郝耿,於建国,马帧,杨会国. 中国畜牧兽医. 2010(09)
[9]精子介导法制备GHRH转基因猪的研究[J]. 丁景华,吴珍芳,习欠云,刘小龙,蔡伟光,孟繁民,束刚,王松波,江青艳,张永亮. 中国兽医学报. 2010(05)
[10]不同品种公猪精子活率及运动能力的比较[J]. 伏彭辉,张家庆,毛献宝,范晓明,蒋如明. 黑龙江畜牧兽医. 2010(05)
博士论文
[1]水牛诱导多能干细胞的研究[D]. 邓彦飞.广西大学 2012
硕士论文
[1]公猪精液在不同温度下保存和稀释剂添加不同添加剂保存公猪精液后的一些生理生化变化[D]. 陈东峰.广西大学 2013
[2]精子载体法介导生产牛转基因胚胎的初步研究[D]. 刘荣立.广西大学 2013
[3]Bmp4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制[D]. 丁祥云.山东大学 2013
[4]Bmp4/Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用及其机制研究[D]. 李毅.山东大学 2012
[5]狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及免疫试验[D]. 房丽君.吉林大学 2011
[6]利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究[D]. 孙克宁.河南农业大学 2011
[7]猪精子介导基因转移技术优化研究[D]. 周辉云.扬州大学 2011
[8]二甲基亚砜（DMSO）增强细胞膜穿透肽TAT穿膜效率的实验研究[D]. 王琥.三峡大学 2010
[9]蜂毒短肽疏水性尾部增加阳离子聚合物的基因转染效率及其在siRNA转染中的应用[D]. 王颖丽.中国人民解放军军事医学科学院 2008
[10]穿膜肽介导的新型基因转运载体的研究[D]. 张宏达.中国人民解放军军事医学科学院 2008
本文编号：3003206
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