胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究

发布时间：2021-01-31 05:50

　　猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种高度传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。APP通过飞沫传播或感染动物接触传播,定植于猪下呼吸道表皮细胞。APP血清型众多,根据表面多糖抗原性差异可将该病原分为15个血清型。胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区的流行情况具有一定差异,我国已分离到APP血清1、2、3、4、5、7和8型菌株,其中以7型最多,其次为1型、2型和3型。APP致病过程涉及众多毒力因子,目前围绕其致病机制开展了大量研究工作,然而APP早期定植感染的致病机理尚不明确。Ⅳ型菌毛在多种病原菌致病过程中发挥重要作用,其中包括介导粘附定植、突破免疫屏障、影响生物被膜形成、颤搐运动、DNA摄取等。为了更好地控制和预防APP导致的疾病,研究APP致病机理,尤其是APP早期粘附定植的作用机制具有重要意义。本课题对APPⅣ型菌毛的功能和在致病过程发挥的作用进行探讨,并对Ⅳ型菌毛结构蛋白白ApfA的免疫原性与免疫保护力进行了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛介导粘附和定植粘附是细菌建立感染的第一步... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表（ABBREVIATION）
1 文献综述
    1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的概述
        1.1.1 病原学与流行病学
        1.1.2 临床症状和病理变化
        1.1.3 诊断与防治
    1.2 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子
        1.2.1 粘附定植
        1.2.2 营养摄取
        1.2.3 机体损伤
        1.2.4 抵抗宿主免疫防御
        1.2.5 持续感染
    1.3 胸膜肺炎放线杆菌疫苗的研究进展
        1.3.1 灭活疫苗
        1.3.2 亚单位疫苗
        1.3.3 核酸疫苗
        1.3.4 菌影疫苗
        1.3.5 口服疫苗
        1.3.6 弱毒活疫苗
    1.4 细菌Ⅳ型菌毛研究进展
        1.4.1 Ⅳ型菌毛结构与组装
        1.4.2 Ⅳ型菌毛功能
2 胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白APFA功能研究
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 菌株、质粒、细胞及培养条件
        2.2.2 主要试剂及药品
        2.2.3 培养基及抗生素配制
        2.2.4 主要溶液的配制
        2.2.5 引物
        2.2.6 实验动物
        2.2.7 apfA基因缺失突变株及互补菌株的构建和筛选
        2.2.8 蛋白表达及纯化
        2.2.9 小鼠多克隆抗体制备
        2.2.10 细胞粘附实验
        2.2.11 共聚焦显微镜观察细胞粘附实验
        2.2.12 RNA提取及荧光定量PCR
        2.2.13 Western Blot
        2.2.14 小鼠肺部定植实验
        2.2.15 小鼠毒力实验
        2.2.16 生物被膜检测
        2.2.17 细胞毒性检测
        2.2.18 溶血实验
        2.2.19 CD46分子表达检测
        2.2.20 酵母双杂交
        2.2.21 统计学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 APP apfA基因缺失突变株、及互补菌株的构建
        2.3.2 ApfA重组蛋白表达纯化
        2.3.3 APP Ⅳ型菌毛基因簇细胞接触表达检测
        2.3.4 ApfA对APP细胞粘附能力的影响
        2.3.5 ApfA对APP小鼠定植能力及毒力的影响
        2.3.6 ApfA对APP生物被膜形成能力的影响
        2.3.7 ApfA对APP溶血活性、细胞毒性的影响
        2.3.8 CD46分子粘附受体验证
        2.3.9 Ⅳ型菌毛宿主互作蛋白筛选
    2.4 讨论
        2.4.1 Ⅳ型菌毛与粘附定植
        2.4.2 Ⅳ型菌毛其他功能
        2.4.3 Ⅳ型菌毛受体寻找
3 胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白APFA免疫原性分析
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要试剂及药品
        3.2.2 主要溶液的配制
        3.2.3 实验动物
        3.2.4 抗体效价检测
        3.2.5 抗体分型
        3.2.6 小鼠主动免疫实验
        3.2.7 小鼠被动免疫试验
        3.2.8 生物信息学及统计学分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 ApfA保守型分析
        3.3.2 ApfA抗体效价检测
        3.3.3 ApfA体内表达检测
        3.3.4 ApfA多克隆抗体检测分型
        3.3.5 ApfA小鼠免疫保护力分析
        3.3.6 ApfA小鼠被动免疫保护力分析
    3.4 讨论
        3.4.1 APP Ⅳ型菌毛基因的分布与保守性
        3.4.2 ApfA与保护性抗原
        3.4.3 ApfA开发成亚单位疫苗的潜力
4 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗[J]. 贝为成,严琳,何启盖,肖少波,陈焕春.  农业生物技术学报. 2005(05)
[2]猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的研究——效力、最小免疫量、免疫持续期和保存期试验[J]. 逯忠新,赵萍,邵英德,柳纪省,鲁炳义,邱昌庆,李宝玉,叶培根,陈焕春,吴斌.  中国兽医科技. 2002(05)
[3]胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防[J]. 张彦明,张耀相,刘春花,李健强.  中国兽医科技. 2002(05)
[4]猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J]. 陈小玲,杨旭夫,朱士盛.  中国兽医杂志. 2001(07)
[5]用间接血凝试验检测猪传染性胸膜肺炎[J]. 逯忠新,鲁炳义,赵萍.  中国兽医科技. 1999(10)
[6]猪传染性胸膜肺炎的诊断与防治[J]. 蔡宝祥.  辽宁畜牧兽医. 1996(03)
[7]胸膜肺炎放线杆菌血清型的地理分布[J]. 吴硕显.  中国兽医杂志. 1995(01)

博士论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D]. 贝为成.华中农业大学 2005

硕士论文
[1]与猪链球菌2型SntA蛋白互作的猪脑组织蛋白质的鉴定[D]. 万云.华中农业大学 2009



本文编号：3010316