携带不同ORF3基因的猪流行性腹泻病毒的拯救及其在VERO细胞上的增殖特性研究
发布时间：2021-01-31 15:22
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起,其大规模的爆发给养猪业造成巨大的经济损失。PEDV属冠状病毒科α冠状病毒属,其基因组为单股正链RNA,编码非结构蛋白1A/1B和结构蛋白S、E、M、N。Orf3是位于PEDV s基因和e基因之间的第三阅读框,是目前发现的PEDV的唯一一个附属基因,编码ORF3蛋白,有关其功能是PEDV的研究热点之一。兽医界普遍认为其与PEDV的毒力相关,但在现有的研究中,受研究手段的限制,对其生物学作用和机理还了解不多。本研究的研究内容及结果如下:（1）3株重组病毒的拯救及鉴定。通过构建带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组质粒,利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作系统拯救3株携带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV,终末稀释法纯化病毒,并经RT-PCR法和免疫组化对获得的重组病毒进行鉴定。RT-PCR结果及细胞病变观察证明...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
猪感染PEDV后剖检观察图
图 1-2 PEDV 病毒粒子形态结构示意图A. PEDV 结构示意图；B. PEDV 病毒粒子电镜观察形态结构图Figure1-2 Schematic representation and electro-microscopic view of PEDV virusA. Schematic structure of PEDV; B. PEDV particles Observed through Electron microscope对于 PEDV 传代细胞的培养，国内外学者虽然探索多年但一直没有突破性进展，这在很大程度上制约了 PEDV 的相关研究。直到 1988 年，瑞士学者 Hofmann等通过在 Vero 细胞的培养基中加入胰酶培养，成功的观察到细胞病变，并检测到PEDV[25]。胰酶对于 PEDV 的增殖到底有什么作用呢？有研究报告证实，在细胞培养过程中，外源性胰酶有助于 PEDV 从感染的细胞表面向周围细胞扩散，在病毒释放过程中发挥重要的作用[26]。1.2.3 PEDV 的理化特性PEDV 在 4℃，PH 5.0~9.0 及 37℃条件下较为稳定。在 60℃环境下 30min 可使其失活。PEDV 对乙醚和氯仿敏感，在蔗糖中的密度为 1.18g/mL。有研究表明，正常情况下 PEDV 不能凝集猪、家兔、小鼠、人、牛、羊、鸡的红细胞，但经适当浓度的胰酶作用下，在 37℃环境下，30min 后可以使兔子的红细胞有效凝集，
上海海洋大学硕士学位论文1.2.5 PEDV 基因组的复制冠状病毒的宿主范围有限，仅感染特定的天然宿主，PEDV 也是如此。PEDVS 蛋白的 S1 结构域的 N-端区域对于识别受体具有重要作用[30]。如图 1-2 所示，PEDV 复制首先是 S 蛋白识别到受体猪氨肽酶 N（Porcine aminopeptidase N，pAPN）[31,32]并与之结合通过膜融合或胞饮方式将病毒导入靶细胞，随后在细胞质中开始基因组复制，最终以胞吐的形式释放到细胞外。
【参考文献】：
期刊论文
[1]浅谈猪流行性腹泻病的流行特点及防治[J]. 张保平. 现代畜牧科技. 2017(10)
[2]猪流行性腹泻疫苗研究和开发进展[J]. 李春华,王荣谈,何锡忠,丁卫星,蒋凤英,倪建平,赵本进. 上海农业学报. 2017(05)
[3]猪流行性腹泻的流行特点及流行现状浅析[J]. 杨先宝. 南方农业. 2017(08)
[4]初生仔猪流行性腹泻的诊断和防治措施分析[J]. 包高良,刘孟洲,王玉安,李爱赟,许国华,权群学,杨海燕,秦学春. 养猪. 2017(04)
[5]猪流行性腹泻病毒Nsp7的亚细胞定位和对Ⅰ型干扰素应答的影响[J]. 李红杰,王晓雪,高冬生,黄慧敏,陈陆,常洪涛,王川庆,李永涛,赵军. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[6]中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展[J]. 施标,董世娟,朱于敏,于瑞嵩,李震. 中国农业科学. 2013(20)
[7]2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J]. 郑逢梅,霍金耀,赵军,常洪涛,王晓梦,陈陆,王川庆. 病毒学报. 2013(02)
[8]猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析[J]. 王隆柏,吴学敏,车勇良,陈如敬,魏宏,刘玉涛,庄向生,周伦江. 中国动物传染病学报. 2012(03)
[9]完善我国动物疫病净化措施[J]. 刘芳,贾幼陵,杜雅楠. 中国兽医杂志. 2012(03)
[10]中国无疫区建设与动物疫病净化[J]. 刘芳,贾幼陵,杜雅楠. 中国动物检疫. 2011(01)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
本文编号：3011130
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
猪感染PEDV后剖检观察图
图 1-2 PEDV 病毒粒子形态结构示意图A. PEDV 结构示意图；B. PEDV 病毒粒子电镜观察形态结构图Figure1-2 Schematic representation and electro-microscopic view of PEDV virusA. Schematic structure of PEDV; B. PEDV particles Observed through Electron microscope对于 PEDV 传代细胞的培养，国内外学者虽然探索多年但一直没有突破性进展，这在很大程度上制约了 PEDV 的相关研究。直到 1988 年，瑞士学者 Hofmann等通过在 Vero 细胞的培养基中加入胰酶培养，成功的观察到细胞病变，并检测到PEDV[25]。胰酶对于 PEDV 的增殖到底有什么作用呢？有研究报告证实，在细胞培养过程中，外源性胰酶有助于 PEDV 从感染的细胞表面向周围细胞扩散，在病毒释放过程中发挥重要的作用[26]。1.2.3 PEDV 的理化特性PEDV 在 4℃，PH 5.0~9.0 及 37℃条件下较为稳定。在 60℃环境下 30min 可使其失活。PEDV 对乙醚和氯仿敏感，在蔗糖中的密度为 1.18g/mL。有研究表明，正常情况下 PEDV 不能凝集猪、家兔、小鼠、人、牛、羊、鸡的红细胞，但经适当浓度的胰酶作用下，在 37℃环境下，30min 后可以使兔子的红细胞有效凝集，
上海海洋大学硕士学位论文1.2.5 PEDV 基因组的复制冠状病毒的宿主范围有限，仅感染特定的天然宿主，PEDV 也是如此。PEDVS 蛋白的 S1 结构域的 N-端区域对于识别受体具有重要作用[30]。如图 1-2 所示，PEDV 复制首先是 S 蛋白识别到受体猪氨肽酶 N（Porcine aminopeptidase N，pAPN）[31,32]并与之结合通过膜融合或胞饮方式将病毒导入靶细胞，随后在细胞质中开始基因组复制，最终以胞吐的形式释放到细胞外。
【参考文献】：
期刊论文
[1]浅谈猪流行性腹泻病的流行特点及防治[J]. 张保平. 现代畜牧科技. 2017(10)
[2]猪流行性腹泻疫苗研究和开发进展[J]. 李春华,王荣谈,何锡忠,丁卫星,蒋凤英,倪建平,赵本进. 上海农业学报. 2017(05)
[3]猪流行性腹泻的流行特点及流行现状浅析[J]. 杨先宝. 南方农业. 2017(08)
[4]初生仔猪流行性腹泻的诊断和防治措施分析[J]. 包高良,刘孟洲,王玉安,李爱赟,许国华,权群学,杨海燕,秦学春. 养猪. 2017(04)
[5]猪流行性腹泻病毒Nsp7的亚细胞定位和对Ⅰ型干扰素应答的影响[J]. 李红杰,王晓雪,高冬生,黄慧敏,陈陆,常洪涛,王川庆,李永涛,赵军. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[6]中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展[J]. 施标,董世娟,朱于敏,于瑞嵩,李震. 中国农业科学. 2013(20)
[7]2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J]. 郑逢梅,霍金耀,赵军,常洪涛,王晓梦,陈陆,王川庆. 病毒学报. 2013(02)
[8]猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析[J]. 王隆柏,吴学敏,车勇良,陈如敬,魏宏,刘玉涛,庄向生,周伦江. 中国动物传染病学报. 2012(03)
[9]完善我国动物疫病净化措施[J]. 刘芳,贾幼陵,杜雅楠. 中国兽医杂志. 2012(03)
[10]中国无疫区建设与动物疫病净化[J]. 刘芳,贾幼陵,杜雅楠. 中国动物检疫. 2011(01)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
本文编号：3011130
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