牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的真核表达及免疫保护效果评价

发布时间：2017-04-12 12:42

  本文关键词：牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的真核表达及免疫保护效果评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛乳房炎是一种能引起乳房炎症的疾病,也是奶牛最为常见的疾病之一,它给养殖业带来巨大的经济损失,同时也给公共卫生安全带来了巨大的隐患。本研究内容和主要结果如下。1、对从奶牛乳房炎病例中分离的33株金黄色葡萄球菌进行溶血素基因型和表型检测,并对它们之间的相关性进行分析。结果表明:hla、hlb、hld、hlg、hlg-2基因的检出率分别为90.91%、100%、93.94%、78.79%、66.67%;金黄色葡萄球菌在牛血和绵羊血琼脂平板上均以β溶血为主,但牛血检测出的β溶血比例更高,溶血素基因型和表现型之间无对应关系。2、将β-溶血素基因定向插入到pcDNA3.1 HisB载体上,成功构建了重组的真核表达载体pcDNA3.1 HisB-hlb。用脂质体法将其转染入人乳腺癌细胞内,使用G418筛选出稳定转染的细胞系,用PCR、Western blot等方法检测检测重组质粒的转染情况。发现pcDNA3.1 HisB-hlb已成功转染入细胞内并正确表达β-溶血素。3、用镍柱亲和层析法对表达产物进行纯化,并测定纯化后的β-溶血素对牛和绵羊红细胞的溶血效价,SDS-PAGE电泳显示纯化产物纯度达电泳纯,并在41.8KDa呈现单一条带,对牛红细胞和绵羊红细胞的溶血比活分别为1658HU/mg和829HU/mg。4、分别将纯化的β-溶血素和pcDNA3.1 His B-hlb与福氏佐剂乳化混合,制成亚单位疫苗和DNA疫苗,通过不同的途径对小鼠进行免疫,强化免疫10天后,用ELISA法检测白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、免疫球蛋白G、分泌性免疫球蛋白A和γ-干扰素等的浓度,同时用金黄色葡萄球菌对小鼠攻毒,对免疫效果进行初步评价。结果表明,各实验组的免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)的浓度远大于对照组,差异显著;β-溶血素和和pcDNA3.1HisB-hlb对小鼠均有一定的保护能力。
【关键词】：奶牛 乳房炎 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 真核表达载体 亚单位疫苗 DNA疫苗 细胞因子
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.611
【目录】：

• 缩略词对照表4-6
• 摘要6-7
• Summary7-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1 奶牛乳房炎危害12-15
• 1.1 奶牛乳房炎的危害12-13
• 1.2 金黄色葡萄球菌概述13-15
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌的危害13
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌毒力因子13-15
• 2 金黄色葡萄球菌 β-溶血素研究进展15-17
• 2.1 金黄色葡萄球菌溶血素的分类15-16
• 2.2 金黄色葡萄球菌 β-溶血素的制备16-17
• 2.3 金黄色葡萄球菌 β-溶血素纯化方法17
• 3 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展17-19
• 3.1 灭活苗17-18
• 3.2 亚单位疫苗18
• 3.3 重组载体疫苗18
• 3.4 合成肽疫苗18-19
• 3.5 基因疫苗19
• 3.6 基因缺失疫苗19
• 4 研究目的和意义19-20
• 第二章 实验研究20-57
• 实验一 溶血素基因型和表型相关性分析20-30
• 1 材料与方法20-23
• 1.1 菌株20
• 1.2 方法20-23
• 1.2.1 主要溶液的配制20-21
• 1.2.2 溶血素基因检测21-23
• 1.2.2.1 引物设计与合成21
• 1.2.2.2 基因组DNA的提取21-22
• 1.2.2.3 PCR扩增与凝胶电泳22-23
• 1.2.2.4 测序23
• 1.2.3 溶血性检测23
• 2 结果23-28
• 2.1 基因组DNA提取结果23-24
• 2.2 溶血素基因检测结果24
• 2.3 溶血性检测结果24-25
• 2.4 溶血素基因型和表型相关性分析25-28
• 3 讨论28-30
• 实验二 β-溶血素基因真核重组质粒的构建与表达30-44
• 1 材料与方法30-40
• 1.1 材料30
• 1.1.1 菌株与质粒30
• 1.1.2 主要仪器和试剂30
• 1.2 实验方法30-40
• 1.2.1 主要溶液的配制30-32
• 1.2.2 重组质粒pcDNA3.1 HisB-hlb的构建32-33
• 1.2.3 质粒的提取33-34
• 1.2.4 pcDNA HisB-hlb的测序和酶切鉴定34
• 1.2.5 pcDNA HisB-hlb在MCF-7 中的表达34-35
• 1.2.5.1 MCF-7 的培养34-35
• 1.2.5.2 转染MCF-735
• 1.2.6 反转录35-37
• 1.2.6.1 细胞总RNA的提取35-36
• 1.2.6.2 反转录合成cDNA36-37
• 1.2.7 PCR检测cDNA37
• 1.2.8 Western blot检测重组质粒的表达37-40
• 1.2.8.1 细胞总蛋白的提取37-38
• 1.2.8.2 SDS-PAGE电泳38-39
• 1.2.8.3 转膜39
• 1.2.8.4 封闭与抗体孵育39
• 1.2.8.5 显色39
• 1.2.8.6 曝光39-40
• 2 结果40-43
• 2.1 pcDNA3.1 HisB-hlb合成结果40
• 2.2 pcDNA3.1 HisB-hlb的酶切鉴定40-41
• 2.3 MCF-7 转染pcDNA3.1 HisB-hlb前后的观察41-42
• 2.4 pcDNA3.1 HisB-hlb在MCF-7 中表达情况的检测42-43
• 2.4.1 PCR检测细胞总RNA42-43
• 2.4.2 Western blot检测hlb的表达43
• 3 讨论43-44
• 实验三：β-溶血素的纯化及活性检测44-49
• 1 材料与方法44-46
• 1.1 材料44
• 1.1.2 主要仪器和试剂见附录44
• 1.2 方法44-46
• 1.2.1 蛋白浓度的测定44-45
• 1.2.2 β-溶血素的纯化45-46
• 1.2.3 溶血效价的测定46
• 1.2.3.1 1%红细胞悬液的制备46
• 1.2.3.2 溶血效价的测定46
• 2 结果46-47
• 2.1 β-溶血素纯化结果46-47
• 2.2 溶血效价测定结果47
• 3 讨论47-49
• 实验四：β-溶血素和重组质粒对小鼠的免疫保护49-57
• 1 材料与方法49-53
• 1.1 材料49-50
• 1.1.1 菌株49
• 1.1.2 实验动物49
• 1.1.3 主要仪器49
• 1.1.4 主要试剂49-50
• 1.1.5 主要溶液的配制50
• 1.2 方法50-53
• 1.2.1 疫苗的制备和安全检验50
• 1.2.2 动物免疫50-52
• 1.2.3 免疫血清的制备52
• 1.2.4 ELISA实验52-53
• 1.2.5 攻毒实验53
• 2 结果53-55
• 2.1 疫苗的无菌和安全检验53
• 2.2 ELISA测定结果53
• 2.3 免疫保护结果53-55
• 3 讨论55-57
• 结论57-58
• 附录58-63
• 一、β-溶血素序列58-59
• 二、所用试剂及试剂盒59-61
• 三、所用仪器61-63
• 参考文献63-69
• 致谢69-70
• 作者简介70-71
• 导师简介71-72

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