奶山羊ADRP基因对GMEC脂滴的影响及其分子机制的初步研究
发布时间：2021-02-03 17:22
胞浆脂滴（Cytoplasmic lipid droplets, CLDs）（Martin and Parton2006）（Martin andParton2006）（Martin and Parton2006）（Martin and Parton2006）（Martin and Parton2006）由一个中性脂质构成的疏水核心外被单层脂质分子层构成，在单层膜上还有多种功能各异的蛋白质，从而使脂滴成为一类多功能的动态细胞器，并广泛存在于多种细胞中，脂滴的生理障碍与多种脂代谢疾病和癌症相关。乳脂肪是乳汁中的主要成分之一，并主要以乳脂滴的形式存在，而乳脂滴主要由甘油三酯和少量胆固醇酯外被三层磷脂分子层构成。乳脂滴从乳腺上皮细胞的顶端分泌的过程至少涉及嗜乳脂蛋白（BTN）、黄嘌呤氧化还原酶（XOR）和脂肪分化相关蛋白（ADRP）三种蛋白的作用。ADRP是脂滴表面蛋白家族（PAT家族）的成员之一，其组织表达广泛并被认为参与了脂滴的形成、转运和分泌过程，还可能作为一种脂肪酸结合蛋白促进长链脂肪酸的摄取。ADRP基因在转录水平的表达受到过氧化物酶体增殖激活物受体（peroxisome proli...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 胞浆脂滴与乳脂
1.1.1 脂滴的发现与研究历史
1.1.2 脂滴的大小、数量与结构
1.1.3 脂滴在细胞中的功能
1.1.4 脂滴的形成与生长
1.1.5 脂滴的蛋白
1.1.6 脂滴与其他细胞器的相互作用
1.1.7 脂滴内脂质的动员
1.1.8 脂滴相关的生理和疾病
1.1.9 乳脂与山羊乳
1.2 脂肪分化相关蛋白（perilipin2/ADRP/ adipophilin）与脂质代谢
1.2.1 脂肪分化相关蛋白的发现及其组织分布
1.2.2 ADRP 在组织细胞中对脂质代谢的影响
1.3 脂肪分化相关蛋白基因的表达调控
1.3.1 转录水平的调节
1.3.2 转录后水平的调节
1.4 本研究的目的及意义
第二章 奶山羊 ADRP 基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
引言
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 pAdTrack-CMV-ADRP 腺病毒穿梭载体的构建与鉴定
2.1.4 pAdEasy-ADRP 重组腺病毒载体的构建与鉴定
2.1.5 重组腺病毒的包装与扩增
2.1.6 腺病毒滴度的测定
2.1.7 重组腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 值（最佳感染复数）的确定
2.1.8 重组腺病毒对奶山羊 ADRP 基因过表达和沉默效果检测
2.2 结果与分析
2.2.1 pAdTrack-CMV-ADRP 穿梭载体的构建与鉴定
2.2.2 pAdEasy-ADRP 重组腺病毒载体的构建与鉴定
2.2.3 Ad-ADRP 过表达腺病毒载体的包装、扩增与病毒滴度测定
2.2.4 腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 值的确定
2.2.5 重组腺病毒对奶山羊 ADRP 基因过表达和沉默效果检测
2.3 讨论
2.3.1 关于重组腺病毒载体的构建和病毒包装
2.3.2 关于基因过表达和沉默效率的检测
2.4 小结
第三章 奶山羊 ADRP 基因对 GMEC 脂质含量和脂滴的影响
引言
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要实验仪器
3.1.3 油红 O 染色检测 ADRP 对 GMEC 脂滴生成和脂解的影响
3.1.4 GPO-Trider 法和铜试剂皂化法检测 ADRP 对细胞细胞内甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸的含量的影响
3.1.5 气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测 ADRP 对细胞长链脂肪酸成分和外源油酸摄取的影响
3.1.6 激光共聚焦显微镜检测 ADRP 对细胞脂滴的影响
3.1.7 透射电子显微镜（TEM）检测 ADRP 对细胞中脂滴形态学的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂滴生成的影响
3.2.2 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂质含量的影响
3.2.3 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂肪酸组成和外源油酸摄取的影响
3.2.4 ADRP 基因对乳腺上皮细胞 ATGL 介导的脂解的影响
3.2.5 ADRP 基因对乳腺上皮细胞内脂滴的形态学影响
3.3 讨论
3.3.1 关于 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂质积累的影响
3.3.2 关于 ADRP 对乳腺上皮细胞脂滴大小和分泌的影响
3.4 小结
第四章 奶山羊 ADRP 基因的转录调控研究
引言
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
4.1.2 主要实验仪器
4.1.3 PPARG 及其激动剂对奶山羊 ADRP 基因表达的影响
4.1.4 奶山羊 ADRP 基因启动子的克隆与转录因子结合位点预测
4.1.5 双荧光素酶报告基因试验检测奶山羊 ADRP 基因启动子活性
4.1.6 凝胶电泳迁移试验（EMSA）检测 PPARG 与 ADRP 基因启动子 PPRE 的体外结合情况
4.2 结果与分析
4.2.1 PPARG 及其激动剂对 ADRP 基因表达的影响
4.2.2 ADRP 基因启动子的克隆与转录因子结合位点预测
4.2.3 奶山羊 ADRP 基因启动子活性的鉴定及 PPARG 对启动子活性的影响
4.2.4 PPRE 位点定点突变和缺失对 PPARG 诱导的 ADRP 基因启动子活性的影响
4.2.5 凝胶电泳迁移试验（EMSA）检测 PPARG 与 PPRE 体外结合情况
4.3 讨论
4.4 小结
结论
参考文献
附录
附录 1
附录 2
附录 3
附录 4
附录 5
附录 6
附录 7
附录 8
附录 9
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]脂滴——细胞脂类代谢的细胞器[J]. 张淑妍,杜雅兰,汪洋,刘平生. 生物物理学报. 2010(02)
[2]猪背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的差异表达和主成分分析[J]. 李明洲,李学伟,朱砺,滕晓坤,肖华胜,李强,陈磊. 中国生物化学与分子生物学报. 2008(01)
[3]Adipophilin——脂肪细胞早期分化的标志[J]. 余熠,谷卫. 国外医学(内科学分册). 2005(11)
[4]反义adipophilin寡核苷酸降低ACAT活性（英文）[J]. 袁中华,杨永宗,尹卫东,易光辉,万载阳. 生物化学与生物物理进展. 2004(10)
[5]脂肪分化相关蛋白的研究进展[J]. 於惠敏,宋怀东,陈家伦. 国外医学.内分泌学分册. 2004(03)
[6]批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度[J]. 江千里,王健民,温丽敏,江汕,周虹. 第二军医大学学报. 2002(09)
本文编号：3016883
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 胞浆脂滴与乳脂
1.1.1 脂滴的发现与研究历史
1.1.2 脂滴的大小、数量与结构
1.1.3 脂滴在细胞中的功能
1.1.4 脂滴的形成与生长
1.1.5 脂滴的蛋白
1.1.6 脂滴与其他细胞器的相互作用
1.1.7 脂滴内脂质的动员
1.1.8 脂滴相关的生理和疾病
1.1.9 乳脂与山羊乳
1.2 脂肪分化相关蛋白（perilipin2/ADRP/ adipophilin）与脂质代谢
1.2.1 脂肪分化相关蛋白的发现及其组织分布
1.2.2 ADRP 在组织细胞中对脂质代谢的影响
1.3 脂肪分化相关蛋白基因的表达调控
1.3.1 转录水平的调节
1.3.2 转录后水平的调节
1.4 本研究的目的及意义
第二章 奶山羊 ADRP 基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
引言
2.1 材料与方法
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 pAdTrack-CMV-ADRP 腺病毒穿梭载体的构建与鉴定
2.1.4 pAdEasy-ADRP 重组腺病毒载体的构建与鉴定
2.1.5 重组腺病毒的包装与扩增
2.1.6 腺病毒滴度的测定
2.1.7 重组腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 值（最佳感染复数）的确定
2.1.8 重组腺病毒对奶山羊 ADRP 基因过表达和沉默效果检测
2.2 结果与分析
2.2.1 pAdTrack-CMV-ADRP 穿梭载体的构建与鉴定
2.2.2 pAdEasy-ADRP 重组腺病毒载体的构建与鉴定
2.2.3 Ad-ADRP 过表达腺病毒载体的包装、扩增与病毒滴度测定
2.2.4 腺病毒感染乳腺上皮细胞最佳 MOI 值的确定
2.2.5 重组腺病毒对奶山羊 ADRP 基因过表达和沉默效果检测
2.3 讨论
2.3.1 关于重组腺病毒载体的构建和病毒包装
2.3.2 关于基因过表达和沉默效率的检测
2.4 小结
第三章 奶山羊 ADRP 基因对 GMEC 脂质含量和脂滴的影响
引言
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要实验仪器
3.1.3 油红 O 染色检测 ADRP 对 GMEC 脂滴生成和脂解的影响
3.1.4 GPO-Trider 法和铜试剂皂化法检测 ADRP 对细胞细胞内甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸的含量的影响
3.1.5 气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测 ADRP 对细胞长链脂肪酸成分和外源油酸摄取的影响
3.1.6 激光共聚焦显微镜检测 ADRP 对细胞脂滴的影响
3.1.7 透射电子显微镜（TEM）检测 ADRP 对细胞中脂滴形态学的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂滴生成的影响
3.2.2 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂质含量的影响
3.2.3 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂肪酸组成和外源油酸摄取的影响
3.2.4 ADRP 基因对乳腺上皮细胞 ATGL 介导的脂解的影响
3.2.5 ADRP 基因对乳腺上皮细胞内脂滴的形态学影响
3.3 讨论
3.3.1 关于 ADRP 基因对乳腺上皮细胞脂质积累的影响
3.3.2 关于 ADRP 对乳腺上皮细胞脂滴大小和分泌的影响
3.4 小结
第四章 奶山羊 ADRP 基因的转录调控研究
引言
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
4.1.2 主要实验仪器
4.1.3 PPARG 及其激动剂对奶山羊 ADRP 基因表达的影响
4.1.4 奶山羊 ADRP 基因启动子的克隆与转录因子结合位点预测
4.1.5 双荧光素酶报告基因试验检测奶山羊 ADRP 基因启动子活性
4.1.6 凝胶电泳迁移试验（EMSA）检测 PPARG 与 ADRP 基因启动子 PPRE 的体外结合情况
4.2 结果与分析
4.2.1 PPARG 及其激动剂对 ADRP 基因表达的影响
4.2.2 ADRP 基因启动子的克隆与转录因子结合位点预测
4.2.3 奶山羊 ADRP 基因启动子活性的鉴定及 PPARG 对启动子活性的影响
4.2.4 PPRE 位点定点突变和缺失对 PPARG 诱导的 ADRP 基因启动子活性的影响
4.2.5 凝胶电泳迁移试验（EMSA）检测 PPARG 与 PPRE 体外结合情况
4.3 讨论
4.4 小结
结论
参考文献
附录
附录 1
附录 2
附录 3
附录 4
附录 5
附录 6
附录 7
附录 8
附录 9
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]脂滴——细胞脂类代谢的细胞器[J]. 张淑妍,杜雅兰,汪洋,刘平生. 生物物理学报. 2010(02)
[2]猪背最长肌中肌肉生长和脂肪沉积相关基因的差异表达和主成分分析[J]. 李明洲,李学伟,朱砺,滕晓坤,肖华胜,李强,陈磊. 中国生物化学与分子生物学报. 2008(01)
[3]Adipophilin——脂肪细胞早期分化的标志[J]. 余熠,谷卫. 国外医学(内科学分册). 2005(11)
[4]反义adipophilin寡核苷酸降低ACAT活性（英文）[J]. 袁中华,杨永宗,尹卫东,易光辉,万载阳. 生物化学与生物物理进展. 2004(10)
[5]脂肪分化相关蛋白的研究进展[J]. 於惠敏,宋怀东,陈家伦. 国外医学.内分泌学分册. 2004(03)
[6]批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度[J]. 江千里,王健民,温丽敏,江汕,周虹. 第二军医大学学报. 2002(09)
本文编号：3016883
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