牛狂犬病的病毒全基因组序列分析及病理学研究
发布时间：2021-02-04 07:50
狂犬病是由狂犬病病毒引起的侵害中枢神经系统的一种人畜共患传染病,致死率几乎为100%。2010年底至2013年初,在内蒙古自治区一些奶牛饲养场和放牧区出现了奶牛狂犬病样病例,本文结合本次牛病,对该地区牛狂犬病病毒的分子生物学特征和致病性做了较深入研究,以为狂犬病的防治提供依据。本研究对24个奶牛饲养场（户）和1个放牧区17个病例（12例病牛和5例病犬）进行发病情况、流行病学调查和临床症状观察,以及对病死牛的病理学检查、免疫荧光染色和病毒核酸检测。选取3例典型病例的脑组织通过乳鼠脑内接种,分离病毒。根据GenBank狂犬病病毒的基因序列,设计了PCR的16对引物和末端测序的3条引物,采取RACE和RT-PCR方法,对全基因组序列分段扩增,拼接出病毒的全基因组序列,并对其进行序列比对和遗传演化分析。应用分离的毒株分别经肌肉和脑内接种不同年龄段（1日、4日、10日、2周、3周和4周）的小鼠,研究不同病毒毒株的毒力及其在脑内的分布和定位特征。用分离的毒株脑内接种10日龄乳鼠,在发病濒死期扑杀乳鼠,取脑组织,应用病理组织学染色、透射电镜、免疫荧光、原位杂交等方法,研究脑组织的病理组织学变化、超微...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：216 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
插图和附表清单
縮略语表
1 引言
1.1 病原学
1.1.1 狂犬病毒的分类
1.1.2 狂犬病病毒的分子生物学特点
1.2 流行病学研究进展
1.2.1 传染源和宿主
1.2.2 传播途径
1.2.3 影响发病的因素
1.2.4 狂犬病流行范围
1.3 病理学研究
1.3.1 病理学变化
1.3.2 发病机理研究进展
1.4 狂犬病的诊断与防制
1.4.1 狂犬病的诊断
1.4.2 狂犬病的防制
1.5 研究目的和意义
2 牛狂犬病自然病例的病理学研究
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 方法
2.2 结果
2.2.1 动物自然病例发病情况与临床症状
2.2.2 自然病例病理学检查
2.2.3 自然病例核酸检测
2.3 讨论
2.4 小结
3 3株狂犬病病毒的全基因组测序
3.1 实验材料
3.1.1 狂犬病犬牛脑标本来源
3.1.2 实验动物
3.1.3 狂犬病病毒全基因组测序所用标本
3.1.4 实验道德规范
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 主要试剂
3.2 实验方法
3.2.1 接种用脑组织的处理
3.2.2 接种方法
3.2.3 小鼠接种后观察
3.2.4 接种后直接免疫荧光检测
3.2.5 用于狂犬病毒N基因序列的扩增引物
3.2.6 设计用于分段扩增狂犬病病毒全基因组序列的引物
3.2.7 设计用于病毒基因组末端的基因序列扩增引物
3.2.8 细胞总RNA的提取
3.2.9 cDNA合成
3.2.10 PCR和序列测定
3.2.11 狂犬病病毒基因组末端的基因序列扩增
3.3 实验结果
3.3.1 狂犬病毒分离扩增结果
3.3.2 直接免疫荧光检测结果
3.3.3 狂犬病毒N基因的PCR扩增结果
3.3.4 全基因组序列PCR反应产物电泳结果
3.3.5 狂犬病毒的基因组全长与各基因及其编码区域
3.4 讨论
3.4.1 引物设计
3.4.2 确保序列测定的准确性
3.4.3 全基因组的长度
3.4.4 （G+C）%含量
3.5 小结
4 3株内蒙古狂犬病病毒的全基因组序列的分析
4.1 材料与方法
4.1.1 用于狂犬病毒全基因组序列分析的参考序列
4.1.2 用于狂犬病病毒N基因序列分析的参考序列
4.2 用于序列分析的生物信息学常用软件
4.2.1 用于序列拼接的ATGC软件
4.2.2 ClustalX（1.8）软件
4.2.3 BioEdit软件
4.2.4 GeneDoc软件
4.2.5 MEGA（5）软件
4.2.6 DNAStar（5.01）软件包中MegAlign软件
4.3 狂犬病病毒的全基因组序列分析结果
4.3.1 狂犬病毒全基因序列的同源性分析
4.3.2 各结构基因所编码蛋白情况分析
4.3.3 结构蛋白基因同源性比较
4.3.4 非编码区序列比较
4.3.5 各结构蛋白的功能位点比较
4.4 讨论
4.4.1 3株狂犬病毒街毒株N基因（核蛋白）分析
4.4.2 基因组分子特征
4.4.3 遗传系谱间差异比较
4.4.4 种系发生分析
4.4.5 街毒株与疫苗株的比较研究
4.4.6 同源性分析
4.4.7 3株病毒致病性差异分析
4.5 小结
5 牛狂犬病病毒毒株实验感染小鼠的病理学研究
5.1 材料与方法
5.1.1 实验道德规范
5.1.2 病毒株
5.1.3 实验动物
5.1.4 病毒悬液的制备与病毒滴度的检测
5.1.5 狂犬病病毒的接种与接种后观察
5.1.6 小鼠脑组织的收集与组织切片的制备
5.1.7 狂犬病病毒特异性抗原定位
5.1.8 电镜检查
5.1.9 脑标本的病理组织学观察
5.1.10 脑组织切片CD3+T淋巴细胞的免疫荧光染色
5.1.11 CD11b小胶质细胞的免疫荧光染色
5.1.12 活化的半胱天冬酶-3（Caspase-3）的间接免疫荧光染色
5.1.13 微管相关蛋白（MAP-2）的免疫荧光染色
5.1.14 神经细胞MAP-2与狂犬病毒抗原共定位
5.1.15 IL-1βmRNA、RANTES mRNA及TIMP-1 mRNA原位杂交检测
5.1.16 脑组织免疫荧光染色与激光扫描共聚焦观察
5.1.17 数据处理与统计
5.2 实验结果
5.2.1 乳鼠接种病毒后的脑内病毒滴度、体重变化及病死率
5.2.2 外周和颅内两种接种方式对不同年龄段小鼠的致病性和感染能力
5.2.3 狂犬病病毒特异性抗原检测结果
5.2.4 神经细胞与神经纤维的病理变化
5.2.5 电镜检查
5.2.6 3株狂犬病毒在发病后濒死前乳鼠脑内的抗原分布
5.2.7 3株狂犬病毒在乳鼠脑组织内不同部位的病毒抗原含量
5.2.8 乳鼠脑组织内CD3+T淋巴细胞的浸润
5.2.9 乳鼠脑组织内CD11b小胶质细胞的活化
5.2.10 3株狂犬病毒乳鼠脑组织内Caspase-3免疫荧光染色结果
5.2.11 乳鼠脑组织微管相关蛋白2的荧光免疫荧光染色结果
5.2.12 乳鼠脑组织病毒抗原与微管相关蛋白2病变的相关性
5.2.13 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞激光扫描共聚焦观察结果
5.2.14 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果
5.2.15 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果
5.2.16 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果
5.3 讨论
5.3.1 乳鼠脑组织神经细胞的病理学变化
5.3.2 3株病毒脑组织内抗原分布差异分析
5.3.3 3株病毒致乳鼠脑组织细胞凋亡情况
5.3.4 乳鼠脑组织炎性细胞情况
5.3.5 乳鼠脑组织神经细胞树突的病变
5.3.6 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞免疫荧光方法特异性鉴定
5.3.7 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果
5.3.8 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果
5.3.9 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果
5.4 小结
6 结论
7 创新点
致谢
附录
参考文献
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]低氧对大鼠大脑皮层细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的影响[J]. 李华华,娄淑杰. 神经解剖学杂志. 2013(02)
[2]微创血肿清除术对大鼠脑出血灶周围组织TNF-α、IL-1β表达的影响[J]. 刘振华,张清华,杜怡峰,王敏忠,赵佳丽. 山东医药. 2012(35)
[3]氧化苦参碱对脑外伤大鼠脑组织IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影响[J]. 董晓巧,俞文华,张祖勇,朱强,车志豪,陈锋,杜权,王昊,陈军. 浙江中西医结合杂志. 2012(07)
[4]公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位[J]. 陈毅,曾长军,周光斌,赖松家,张明. 四川农业大学学报. 2012(02)
[5]The Full-length Genome Analysis of a Street Rabies Virus Strain Isolated in Yunnan Province of China[J]. Jian Zhang1,2, Hai-lin Zhang3**, Xiao-yan Tao2, Hao Li2, Qing Tang2**, Xiu-yun Jiang1 and Guo-dong Liang2 (1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China; 3. Yunnan Institute of Endemic Disease Control and Prevention/ Yunnan Provincial Center of Virus and Rickettsia Research, Dali 671000, China). Virologica Sinica. 2012(03)
[6]Molecular Characterization of Viral G Gene in Emerging and Re-emerging Areas of Rabies in China, 2007 to 2011[J]. Shu-Lin Lang1,2, Xiao-Yan Tao2, Zhen-Yang Guo2,3, Qing Tang2**, Hao Li2, Cui-Ping Yin2, Ying Li1 and Guo-Dong Liang2 (1. College of Animal Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China. 3.State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology Chinese Academy of Science, Wuhan, 430071, China). Virologica Sinica. 2012(03)
[7]炎症相关因子IL-1β,TGF-β及MCP-1在肝细胞肝癌的表达[J]. 沈国定,姜润秋,孙倍成. 江苏医药. 2011(07)
[8]大鼠脑打击伤后脑组织IL-1β的表达及药物的神经保护作用[J]. 陈兵,彭浩,尹延庆,吴华伟,梁远生,邹新辉,龙霄翱. 中国现代医学杂志. 2010(17)
[9]黄芪总苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表达的影响[J]. 黄小平,谭华,陈北阳,邓常清. 中国中药杂志. 2010(16)
[10]miR-125a调节系统性红斑狼疮患者T细胞炎症性趋化因子RANTES的表达[J]. 赵遐,唐元家,曲波,崔慧娟,王树军,王立珈,黄新芳,陈顺乐,沈南. 现代免疫学. 2010(03)
博士论文
[1]趋化因子RANTES在附睾的表达及功能研究[D]. 孙质健.第四军医大学 2010
硕士论文
[1]肠外致病性大肠杆菌E044株的质粒克隆分析及激活RANTES的分子机制研究[D]. 陈周.华中农业大学 2009
本文编号：3017988
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：216 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
插图和附表清单
縮略语表
1 引言
1.1 病原学
1.1.1 狂犬病毒的分类
1.1.2 狂犬病病毒的分子生物学特点
1.2 流行病学研究进展
1.2.1 传染源和宿主
1.2.2 传播途径
1.2.3 影响发病的因素
1.2.4 狂犬病流行范围
1.3 病理学研究
1.3.1 病理学变化
1.3.2 发病机理研究进展
1.4 狂犬病的诊断与防制
1.4.1 狂犬病的诊断
1.4.2 狂犬病的防制
1.5 研究目的和意义
2 牛狂犬病自然病例的病理学研究
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 方法
2.2 结果
2.2.1 动物自然病例发病情况与临床症状
2.2.2 自然病例病理学检查
2.2.3 自然病例核酸检测
2.3 讨论
2.4 小结
3 3株狂犬病病毒的全基因组测序
3.1 实验材料
3.1.1 狂犬病犬牛脑标本来源
3.1.2 实验动物
3.1.3 狂犬病病毒全基因组测序所用标本
3.1.4 实验道德规范
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 主要试剂
3.2 实验方法
3.2.1 接种用脑组织的处理
3.2.2 接种方法
3.2.3 小鼠接种后观察
3.2.4 接种后直接免疫荧光检测
3.2.5 用于狂犬病毒N基因序列的扩增引物
3.2.6 设计用于分段扩增狂犬病病毒全基因组序列的引物
3.2.7 设计用于病毒基因组末端的基因序列扩增引物
3.2.8 细胞总RNA的提取
3.2.9 cDNA合成
3.2.10 PCR和序列测定
3.2.11 狂犬病病毒基因组末端的基因序列扩增
3.3 实验结果
3.3.1 狂犬病毒分离扩增结果
3.3.2 直接免疫荧光检测结果
3.3.3 狂犬病毒N基因的PCR扩增结果
3.3.4 全基因组序列PCR反应产物电泳结果
3.3.5 狂犬病毒的基因组全长与各基因及其编码区域
3.4 讨论
3.4.1 引物设计
3.4.2 确保序列测定的准确性
3.4.3 全基因组的长度
3.4.4 （G+C）%含量
3.5 小结
4 3株内蒙古狂犬病病毒的全基因组序列的分析
4.1 材料与方法
4.1.1 用于狂犬病毒全基因组序列分析的参考序列
4.1.2 用于狂犬病病毒N基因序列分析的参考序列
4.2 用于序列分析的生物信息学常用软件
4.2.1 用于序列拼接的ATGC软件
4.2.2 ClustalX（1.8）软件
4.2.3 BioEdit软件
4.2.4 GeneDoc软件
4.2.5 MEGA（5）软件
4.2.6 DNAStar（5.01）软件包中MegAlign软件
4.3 狂犬病病毒的全基因组序列分析结果
4.3.1 狂犬病毒全基因序列的同源性分析
4.3.2 各结构基因所编码蛋白情况分析
4.3.3 结构蛋白基因同源性比较
4.3.4 非编码区序列比较
4.3.5 各结构蛋白的功能位点比较
4.4 讨论
4.4.1 3株狂犬病毒街毒株N基因（核蛋白）分析
4.4.2 基因组分子特征
4.4.3 遗传系谱间差异比较
4.4.4 种系发生分析
4.4.5 街毒株与疫苗株的比较研究
4.4.6 同源性分析
4.4.7 3株病毒致病性差异分析
4.5 小结
5 牛狂犬病病毒毒株实验感染小鼠的病理学研究
5.1 材料与方法
5.1.1 实验道德规范
5.1.2 病毒株
5.1.3 实验动物
5.1.4 病毒悬液的制备与病毒滴度的检测
5.1.5 狂犬病病毒的接种与接种后观察
5.1.6 小鼠脑组织的收集与组织切片的制备
5.1.7 狂犬病病毒特异性抗原定位
5.1.8 电镜检查
5.1.9 脑标本的病理组织学观察
5.1.10 脑组织切片CD3+T淋巴细胞的免疫荧光染色
5.1.11 CD11b小胶质细胞的免疫荧光染色
5.1.12 活化的半胱天冬酶-3（Caspase-3）的间接免疫荧光染色
5.1.13 微管相关蛋白（MAP-2）的免疫荧光染色
5.1.14 神经细胞MAP-2与狂犬病毒抗原共定位
5.1.15 IL-1βmRNA、RANTES mRNA及TIMP-1 mRNA原位杂交检测
5.1.16 脑组织免疫荧光染色与激光扫描共聚焦观察
5.1.17 数据处理与统计
5.2 实验结果
5.2.1 乳鼠接种病毒后的脑内病毒滴度、体重变化及病死率
5.2.2 外周和颅内两种接种方式对不同年龄段小鼠的致病性和感染能力
5.2.3 狂犬病病毒特异性抗原检测结果
5.2.4 神经细胞与神经纤维的病理变化
5.2.5 电镜检查
5.2.6 3株狂犬病毒在发病后濒死前乳鼠脑内的抗原分布
5.2.7 3株狂犬病毒在乳鼠脑组织内不同部位的病毒抗原含量
5.2.8 乳鼠脑组织内CD3+T淋巴细胞的浸润
5.2.9 乳鼠脑组织内CD11b小胶质细胞的活化
5.2.10 3株狂犬病毒乳鼠脑组织内Caspase-3免疫荧光染色结果
5.2.11 乳鼠脑组织微管相关蛋白2的荧光免疫荧光染色结果
5.2.12 乳鼠脑组织病毒抗原与微管相关蛋白2病变的相关性
5.2.13 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞激光扫描共聚焦观察结果
5.2.14 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果
5.2.15 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果
5.2.16 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果
5.3 讨论
5.3.1 乳鼠脑组织神经细胞的病理学变化
5.3.2 3株病毒脑组织内抗原分布差异分析
5.3.3 3株病毒致乳鼠脑组织细胞凋亡情况
5.3.4 乳鼠脑组织炎性细胞情况
5.3.5 乳鼠脑组织神经细胞树突的病变
5.3.6 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞免疫荧光方法特异性鉴定
5.3.7 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果
5.3.8 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果
5.3.9 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果
5.4 小结
6 结论
7 创新点
致谢
附录
参考文献
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]低氧对大鼠大脑皮层细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的影响[J]. 李华华,娄淑杰. 神经解剖学杂志. 2013(02)
[2]微创血肿清除术对大鼠脑出血灶周围组织TNF-α、IL-1β表达的影响[J]. 刘振华,张清华,杜怡峰,王敏忠,赵佳丽. 山东医药. 2012(35)
[3]氧化苦参碱对脑外伤大鼠脑组织IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影响[J]. 董晓巧,俞文华,张祖勇,朱强,车志豪,陈锋,杜权,王昊,陈军. 浙江中西医结合杂志. 2012(07)
[4]公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位[J]. 陈毅,曾长军,周光斌,赖松家,张明. 四川农业大学学报. 2012(02)
[5]The Full-length Genome Analysis of a Street Rabies Virus Strain Isolated in Yunnan Province of China[J]. Jian Zhang1,2, Hai-lin Zhang3**, Xiao-yan Tao2, Hao Li2, Qing Tang2**, Xiu-yun Jiang1 and Guo-dong Liang2 (1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China; 3. Yunnan Institute of Endemic Disease Control and Prevention/ Yunnan Provincial Center of Virus and Rickettsia Research, Dali 671000, China). Virologica Sinica. 2012(03)
[6]Molecular Characterization of Viral G Gene in Emerging and Re-emerging Areas of Rabies in China, 2007 to 2011[J]. Shu-Lin Lang1,2, Xiao-Yan Tao2, Zhen-Yang Guo2,3, Qing Tang2**, Hao Li2, Cui-Ping Yin2, Ying Li1 and Guo-Dong Liang2 (1. College of Animal Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China. 3.State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology Chinese Academy of Science, Wuhan, 430071, China). Virologica Sinica. 2012(03)
[7]炎症相关因子IL-1β,TGF-β及MCP-1在肝细胞肝癌的表达[J]. 沈国定,姜润秋,孙倍成. 江苏医药. 2011(07)
[8]大鼠脑打击伤后脑组织IL-1β的表达及药物的神经保护作用[J]. 陈兵,彭浩,尹延庆,吴华伟,梁远生,邹新辉,龙霄翱. 中国现代医学杂志. 2010(17)
[9]黄芪总苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表达的影响[J]. 黄小平,谭华,陈北阳,邓常清. 中国中药杂志. 2010(16)
[10]miR-125a调节系统性红斑狼疮患者T细胞炎症性趋化因子RANTES的表达[J]. 赵遐,唐元家,曲波,崔慧娟,王树军,王立珈,黄新芳,陈顺乐,沈南. 现代免疫学. 2010(03)
博士论文
[1]趋化因子RANTES在附睾的表达及功能研究[D]. 孙质健.第四军医大学 2010
硕士论文
[1]肠外致病性大肠杆菌E044株的质粒克隆分析及激活RANTES的分子机制研究[D]. 陈周.华中农业大学 2009
本文编号：3017988
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