绵羊肺炎支原体溶血素蛋白的原核表达与免疫学特性的研究

发布时间：2021-02-05 20:56

　　绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae.MO）是一种高度接触性传染病,在世界上流行范围极大,可以造成绵羊和山羊的传染性胸膜肺炎。由于支原体生物结构上的特殊性,导致大部分的抗生素类药物对其无效。因为支原体的人工培养难度较大,生长周期长,从而使其在传统疫苗研究工作上也进展缓慢。随着生物化学和生物工程信息技术的发展,人们开始着重于研究新型的疫苗。本实验从绵羊肺炎支原体的全基因组开始,通过绵羊肺炎支原体培养过程中的溶血现象。来进行溶血素蛋白基因的克隆,并且通过原核表达来研究其蛋白的活性。首先在基因片段的克隆上,由于TGA在大肠杆菌的表达系统中为终止密码子,通过定点突变的方法将绵羊肺炎支原体的溶血素（hemolysin）基因上面的TGA突变为TGG,使克隆后的基因片段在大肠杆菌的表达系统中与在支原体的表达系统中相一致。将克隆好的基因片段与PET32a质粒进行连接,并转入可以大量表达蛋白的大肠杆菌感受态细胞中。经过对诱导条件的研究,经过SDS-PAGE电泳实验证明,可以表达出正确的目的蛋白,其大小为44.5kDa,将经过纯化的蛋白进行western blot实验,结果证明... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：48 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
插图和附表清单
缩略语表
1. 引言
    1.1 绵羊肺炎支原体的概述
        1.1.1 病原学
        1.1.2 流行病学
        1.1.3 致病机理
        1.1.4 临床症状和病理变化
    1.2 绵羊肺炎支原体的研究现状
        1.2.1 免疫活性与疫苗的研究进展
        1.2.2 绵羊肺炎基因组的研究进展
    1.3 本实验的研究目的和意义以及实验思路
        1.3.1 实验目的和意义
        1.3.2 实验思路
2. 绵羊肺炎支原体溶血素基因的克隆和原核表达
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 实验器材
        2.1.3 主要试剂及溶液
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 引物的设计
        2.2.2 基因组模板的制备
        2.2.3 PCR扩增反应体系
        2.2.4 Hemolysin328基因的定点突变与克隆连接
        2.2.5 基因片段与PET32A质粒载体的连接
        2.2.6 重组质粒转化DH5 α感受态细胞
        2.2.7 重组质粒的PCR鉴定
        2.2.8 测序鉴定
        2.2.9 重组质粒的提取
        2.2.10 重组蛋白的表达
        2.2.11 融合蛋白表达诱导条件的确定
        2.2.12 重组蛋白的表达纯化
        2.2.13 蛋白浓度的测定
        2.2.14 目的蛋白的Western blot分析
        2.2.15 重组蛋白的溶血实验
    2.3 实验结果
        2.3.1 Hemolysin328基因片段的PCR反应结果
        2.3.2 重组质粒PCR测序结果
        2.3.3 融合蛋白诱导条件
        2.3.4 梯度浓度咪唑洗脱液洗脱蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定
        2.3.5 蛋白浓度测定的结果
        2.3.6 western blot结果
        2.3.7 溶血实验结果
    2.4 讨论与分析
        2.4.1 构建能够表达重组蛋白的质粒
        2.4.2 表达系统的选择
        2.4.3 重组蛋白诱导条件和可溶性的分析
        2.4.4 重组蛋白纯化方法的选择
        2.4.5 选择溶血素蛋白的目的
3. 绵羊肺炎支原体的溶血素蛋白的免疫原性研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要溶液配制
        3.1.4 主要器材
    3.2 实验方法
        3.2.1 制备疫苗
        3.2.2 免疫动物
        3.2.3 免疫血清的制备
        3.2.4 检测免疫小鼠血清特异性抗体
        3.2.5 脾脏T淋巴细胞增殖实验
    3.3 实验结果
        3.3.1 血清特异性抗体水平检测
        3.3.2 脾脏T细胞增殖实验结果
    3.4 讨论与分析
        3.4.1 特异性抗体水平的检测
        3.4.2 脾脏T淋巴细胞增殖实验
4. 结论
致谢
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊传染性胸膜肺炎病原分离与鉴定[J]. 杜永凤,文心田,曹三杰,肖驰,易佳.  中国预防兽医学报. 2006(06)
[2]Interactions between mycoplasma lipid-associated membrane proteins and the host cells[J]. YOU Xiao-xing, ZENG Yan-hua, WU Yi-mou (Institute of Pathogenic Biology, School of Medicine, Nanhua University, Hengyang 421001, China).  Journal of Zhejiang University Science. 2006(05)
[3]类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——病原诊断[J]. 邓光明,赵煊,梁桂香,方畴鑫,李志杰,王永宁,王庆粉,赵文学,陈满功,孙善财.  中国兽医科技. 1991(06)
[4]从山羊分离出绵羊肺炎霉形体的报告[J]. 王栋,刘众心,张立春.  中国兽医杂志. 1991(06)
[5]猪肺炎霉形体兔化弱毒株的超微结构及致病性研究——1.兔化弱毒株的超微结构[J]. 张启敬,徐伟,李继庚,王桂敏,丁庆猷.  电子显微学报. 1989(04)

博士论文
[1]丝状支原体PG3株和绵羊肺炎支原体内蒙分离株基因组测序及可变表面脂蛋白基因克隆表达[D]. 徐春光.内蒙古农业大学 2013

硕士论文
[1]猪链球菌2型SLY与EF蛋白的原核表达及生物学特性鉴定[D]. 陈正涛.山东农业大学 2012



本文编号：3019567