鸭瘟病毒UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位研究

发布时间：2021-02-06 04:02

　　目前还未见DPV UL17基因功能研究的报道,本论文对DPV-CHv株的UL17基因（由本实验室注册,GenBank登录号EF643567）进行了生物信息学分析,根据分析结果设计实验,对UL17基因进行原核表达、多克隆抗体制备、转录表达时相分析及UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位研究,结果如下：1. DPV-UL17基因的生物信息学分析生物信息学方法分析DPV-UL17基因,结果表明UL17基因编码蛋白分子量为75.94298 kDa,由684个氨基酸组成,无信号肽位点及跨膜区。同时该蛋白含19个磷酸化位点、4个糖基化位点和多个抗原表位,预测其主要定位在细胞核和细胞质。2. DPV-UL17基因克隆表达、蛋白纯化和多克隆抗体制备根据DPV UL17基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计出一对特异性引物,并将扩增的UL17全基因克隆入pMD20-T载体中,先后经Xhol和BamHI?酶切后,克隆到原核表达质粒pET-32a （+）中,成功构建了pET32a-UL17重组原核表达质粒。之后转化到BL21（DE3）表达宿主菌,表达的重组蛋白大小约为96... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：42 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
一、引言
    1 文献综述
        1.1 UL17基因序列的特点
        1.2 UL17编码蛋白的特点
        1.3 疱疹病毒UL17蛋白的功能
            1.3.1 DNA切割和组装
            1.3.2 衣壳在细胞内的正常分布
            1.3.3 UL17蛋白与UL25蛋白复合体的作用
            1.3.4 UL17蛋白与其它蛋白的相互作用
    2 选题目的和意义
二、试验研究
    1 材料
        1.1 试验动物
        1.2 基因、载体、毒株、菌株
        1.3 主要仪器设备
        1.4 主要试剂
    2 方法
        2.1 生物信息学分析
        2.2 鸭瘟病毒UL17基因克隆表达、多克隆抗体制备
            2.2.1 引物合成和稀释
            2.2.2 DPV UL17基因扩增
            2.2.3 DPV UL17基因T克隆
            2.2.4 DPV UL17基因T克隆鉴定
            2.2.5 构建pET32a-UL17重组原核表达质粒
            2.2.6 pET32a-UL17重组原核表达质粒的表达
            2.2.7 检测重组UL17蛋白的反应原性
            2.2.8 重组UL17蛋白的纯化
            2.2.9 兔抗重组UL17蛋白多克隆抗体制备
            2.2.10 鼠抗重组UL17蛋白多克隆抗体制备
            2.2.11 多克隆抗体粗提纯化
        2.3 鸭瘟病毒UL17基因转录及表达时相研究
            2.3.1 引物合成及特异性验证
            2.3.2 药物抑制试验确定UL17基因的类型
            2.3.3 DPV UL17基因转录类型研究
            2.3.4 DPV UL17基因表达时相研究
        2.4 鸭瘟病毒UL17基因编码蛋白在DEF中的定位研究
            2.4.1 间接免疫荧光检测DPV UL17蛋白在DEF中的分布
            2.4.2 结果判定标准
        2.5 鸭瘟病毒UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位研究
            2.5.1 双重间接免疫荧光检测DPV UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位情况
            2.5.2 结果判定标准
    3 结果
        3.1 生物信息学分析
            3.1.1 DPV UL17基因核酸序列分析
            3.1.2 DPV UL17蛋白的理化性质
            3.1.3 UL17二级结构、三级结构预测
        3.2 鸭瘟病毒UL17基因克隆表达、多克隆抗体制备
            3.2.1 DPV UL17基因扩增
            3.2.2 T克隆pMD20T-UL17鉴定
            3.2.3 重组表达载体pET32a-UL17鉴定
            3.2.4 重组UL17蛋白表达及纯化
            3.2.5 重组UL17蛋白反应原性检测
            3.2.6 重组蛋白多克隆抗体的制备、纯化
        3.3 鸭瘟病毒UL17基因转录及表达时相研究
            3.3.1 引物特异性验证
            3.3.2 药物抑制试验确定UL17基因的类型
            3.3.3 实时荧光定量PCR标准曲线
            3.3.4 鸭瘟病毒UL17基因转录时相分析
            3.3.5 鸭瘟病毒UL17基因表达时相分析
        3.4 鸭瘟病毒UL17基因编码蛋白在DEF中的定位研究
        3.5 鸭瘟病毒UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位研究
            3.5.1 UL17蛋白与UL25蛋白的共定位情况
            3.5.2 UL17蛋白与UL26.5蛋白的细胞共定位情况
    4 讨论
        4.1 生物信息学分析
        4.2 鸭瘟病毒UL17基因克隆表达、多克隆抗体制备
        4.3 鸭瘟病毒UL17基因转录及表达时相研究
        4.4 鸭瘟病毒UL17基因编码蛋白在DEF中的定位研究
        4.5 鸭瘟病毒UL17蛋白与UL25蛋白、UL26.5蛋白的细胞共定位研究
三、结论
参考文献
致谢
作者简介及攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]疱疹病毒衣壳蛋白及其组装研究进展[J]. 向骏,程安春,汪铭书.  中国农业科学. 2010(22)
[2]利用改进的酚-氯仿法从猪毛囊中提取基因组DNA[J]. 王继英,俞英,冯利霞,王怀中,张勤.  遗传. 2010(07)
[3]兔抗猪瘟高免血清的制备及纯度鉴定[J]. 李娅丽,周洁,李敬玺,李乔木,王丽,柴书军,王选年.  河南农业科学. 2009(05)
[4]鸭肠炎病毒UL6基因B细胞表位的预测及其主要抗原域的原核表达[J]. 孙涛,程安春,汪铭书,郭宇飞,贾仁勇,沈婵娟.  中国兽医科学. 2008(11)
[5]用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律[J]. 程安春,韩晓英,汪铭书,袁桂萍,徐超,廖永洪.  畜牧兽医学报. 2007(09)
[6]琼扩试验检测鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的研究[J]. 杨百亮,郭羽.  天津农学院学报. 2004(04)
[7]实时荧光定量PCR技术及其应用[J]. 欧阳松应,杨冬,欧阳红生,马鹤雯.  生命的化学. 2004(01)

硕士论文
[1]鸭瘟病毒核糖核苷酸还原酶小亚基（R2）基因原核表达及其转录和表达时相分析[D]. 魏敏.四川农业大学 2013
[2]DEV UL53基因主要B细胞抗原表位原核表达及其多克隆抗体制制备和初步应用[D]. 张顺川.四川农业大学 2011
[3]鸭瘟病毒UL26.5基因的原核表达及在病毒感染细胞定位研究[D]. 张瑶.四川农业大学 2009
[4]鸭瘟病毒UL35基因的原核表达、蛋白纯化、转录时相、表达时相及亚细胞定位[D]. 蔡铭升.四川农业大学 2009
[5]鸭瘟病毒UL25基因的原核表达及细胞定位研究[D]. 孙磊.四川农业大学 2009



本文编号：3020115