山羊IFN-γ基因的克隆表达及抗ORFV活性鉴定

发布时间：2021-02-06 16:24

　　山羊细菌性和病毒性疾病对羊群的危害严重，对于这些疾病的治疗，目前还没有特效药。IFN-γ作为一种多效应细胞因子，具有抵抗细菌或是病毒对宿主细胞的入侵，对肿瘤免疫监视，免疫调节等作用。IFN-γ的原核表达产物已被应用于人和动物临床疾病治疗中，本研究开展山羊IFN-γ的克隆表达及抗病毒活性研究，以期为山羊重要疫病的临床治疗提供新的手段。本研究根据Genbank中发布的山羊IFN-γmRNA序列设计引物。分离山羊外周血淋巴细胞，刺激培养后，提取总RNA，反转录得到cDNA，经PCR扩增后得到山羊IFN-γCDs区基因，并构建克隆载体。经测序鉴定后，设计表达引物，PCR扩增得到去掉信号肽的IFN-γ基因，构建表达载体，测序鉴定后进行诱导表达，将原核表达产物纯化后免疫家兔制抗体，并测定原核表达蛋白的生物活性。获得以下结果：1．测序结果表明克隆得到的序列为山羊IFN-γ，与GenBank中公布的其他山羊IFN-γ基因序列相似性均在99%以上。其序列长度为501bp，前69bp编码信号肽序列，后面432bp编码142个氨基酸，蛋白质分子量约15.9ku，蛋白质序列中含有2个潜在N糖基化位点。2．重组... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
综述部分
    第一章 IFN-γ研究进展
        1.1 前言
        1.2 IFN-γ的分子生物学研究进展
            1.2.1 IFN-γ结构
            1.2.2 IFN-γ受体
            1.2.3 IFN-γ的作用机制
        1.3 干扰素的理化性质及免疫学活性
            1.3.1 干扰素的理化性质
            1.3.2 干扰素的免疫学活性
        1.4 干扰素的兽医临床应用
            1.4.1 干扰素应用于病毒病的治疗
            1.4.2 干扰素应用于细菌性疾病的治疗
            1.4.3 IFN-γ的其他应用
        1.5 山羊 IFN-γ研究进展
试验研究
    第二章 山羊 IFN-γ基因的克隆及序列分析
        2.1 材料
            2.1.1 实验动物
            2.1.2 菌株及载体
            2.1.3 主要试剂
            2.1.4 主要仪器
            2.1.5 主要溶液配方
        2.2 方法
            2.2.1 引物设计
            2.2.2 山羊外周血淋巴细胞分离培养
            2.2.3 淋巴细胞总 RNA 提取
            2.2.4 cDNA 的合成和 PCR 扩增
            2.2.5 克隆载体构建
            2.2.6 目的基因序列分析
        2.3 结果与分析
            2.3.1 目的基因 RT-PCR 扩增结果
            2.3.2 重组质粒 PCR 鉴定结果
            2.3.3 克隆质粒酶切鉴定结果
            2.3.4 测序结果分析及 IFN-γ序列分析
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 山羊 IFN-γ基因原核表达
        3.1 材料
            3.1.1 菌种和载体
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器
            3.1.4 主要溶液配方
        3.2 方法
            3.2.1 引物设计
            3.2.2 目的片段克隆
            3.2.3 原核表达载体的构建
            3.2.4 重组蛋白的诱导表达及 Western-blot 检测
            3.2.5 重组蛋白纯化
            3.2.6 多克隆抗体制备
            3.2.7 抗山羊 IFN-γ多抗效价的 ELISA 测定
        3.3 结果
            3.3.1 目的基因 PCR 结果
            3.3.2 IFN-γ重组质粒 PCR 结果
            3.3.3 IFN-γ重组质粒双酶切鉴定结果
            3.3.4 蛋白表达诱导条件优化结果
            3.3.5 重组蛋白 Western-blot 分析结果
            3.3.6 重组蛋白纯化结果
            3.3.7 兔抗重组山羊 IFN-γ蛋白多克隆抗体效价测定
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 重组山羊 IFN-γ抗 ORFV 活性鉴定
        4.1 材料
            4.1.1 试验动物、细胞及毒株
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 主要仪器
            4.1.4 主要试剂配方
        4.2 方法
            4.2.1 IFN-γ抗 ORFV 在山羊胎儿成纤维细胞上的增殖
            4.2.2 ORFV 毒价测定
            4.2.3 ORFV DNA 的提取
            4.2.4 ORFV DNA 的 Q-PCR 反应及标准曲线的建立
            4.2.5 重组 IFN-γ抗 ORFV 试验
            4.2.6 数据分析
        4.3 结果
            4.3.1 ORFV 毒价测定
            4.3.2 标准曲线建立结果
            4.3.3 重组 IFN-γ抗 ORFV 增殖结果
            4.3.4 重组 IFN-γ抗 ORFV 效价测定结果
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
参考文献
缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]奶牛γ-干扰素基因的表达及其在乳房炎防治中的初步应用[D]. 许金俊.扬州大学 2004

硕士论文
[1]羊口疮抗体ELISA检测方法的建立及应用[D]. 李杰.西北农林科技大学 2013
[2]羊口疮疫苗研制及其免疫效果评估[D]. 田婷婷.西北农林科技大学 2013



本文编号：3020745