猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究
发布时间：2021-02-09 10:46
猪病毒性腹泻是一种接触性的肠道传染病,其临床症状为呕吐,腹泻和脱水等。其病原包括猪博卡病毒（Porcine Bocavirus,PBCo V）、诺如病毒（Norovirus,No V）、猪Delta冠状病毒（Porcine Delta Coronavirus,PDCo V）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Variant Diarrhea Virus,PEDV）、轮状病毒（Rotavirus,RV）和猪传染性肠胃炎病毒（Porcine Infectious Gastroenteritis Virus,TGEV）等六种病毒,该类病毒引起的临床症状、流行病学规律和病理变化非常相似,特别是猪性腹泻病毒,其变异毒株不断出现,防控技术要求更高,临床诊断时不易区分其病原体,因此建立一种同一反应、快速、灵敏的检测方法区分将有利于该类疾病的防控。本研究利用多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）和荧光定量RT-PCR技术,分别建立区分6种病毒性腹泻病原体的MLPA检测方法和猪流行性腹泻变异毒株与疫苗毒株的荧光定...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MLPA基础探针构造Figure.1.1MLPAbasicprobeconstruction
25图 1.2 6 种猪腹泻病毒重组表达质粒Figure.1.2 Six porcine diarrhea virus recombinant expression plasmid1.6.1 E.coli 感受态细胞制备（1）准备适量的 1.5 mL 离心管，120℃高压灭菌后，放置烘箱 60℃烘干，置于-80℃冷藏备用。准备多个 250 mL 锥形离心管，自来水洗涤干净后，再用二级水冲洗干净，高压灭菌冷藏备用；（2）同时于-80℃冰箱中取 E.coli，在 LB 平板上划线复苏 E.coli，平板倒置于 37℃静置 12-16 h 培养；（3）从平板上挑出数个单个菌落接种于 10 mL 的 LB 液体培养基中，放入 37℃
品为阳性对照，正常的无菌水为阴性对照，对52份临性的PEDV病毒13份，疑似感染猪病毒性腹泻疾病小肠组泻疾病的鼻咽拭子38份）进行检测，对方法的检测结果时荧光定量PCR的检测方法及病毒鉴定分离结果进行比果准品的制备与验证中的6株病毒提取核酸，然后进行PCR扩增（见图1.3），，连接，转化，摇菌，提取质粒进行酶切和测序鉴定段的重组质粒，经多功能酶标仪测定浓度用无菌水进行×10-10ng /μL的质粒标准品。猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 张琪,徐丽美,周宏超,杨猛超,张淼涛,于三科,许信刚. 中国兽医科学. 2018(02)
[2]猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用[J]. 李苗,周关发,杨莹,张正学,王轶珊. 上海畜牧兽医通讯. 2017(06)
[3]多重连接探针扩增对5种牛病毒同步检测方法的建立[J]. 史喜菊,马贵平,柏亚铎,郝俊虎,乔彩霞,刘全国,李炎鑫,李冰玲. 中国兽医学报. 2017(02)
[4]猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 逄凤娇,张柏猛,何孔旺,俞正玉,徐向伟,郭容利,范宝超,温立斌,李彬,姜平. 畜牧与兽医. 2016(09)
[5]新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 张帆帆,宋德平,周信荣,黄冬艳,李安琪,彭棋,陈燕君,吴琼,何后军,唐玉新. 中国农业科学. 2016(07)
[6]国内首株猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus）的分离鉴定[J]. 陈建飞,王潇博,焦贺勋,时洪艳,张鑫,刘建波,石达,冯力. 中国预防兽医学报. 2016(03)
[7]食源性诺如病毒在果蔬农产品中的污染及检测研究[J]. 谢雅晶,刘贤金. 病毒学报. 2015(06)
[8]猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 张雪,杨倩,于红欣,王俊,孟凡伟,周双海. 中国兽医科学. 2015(06)
[9]检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较[J]. 李楠,王佳慧,李凤琴,徐进,江涛. 中国食品卫生杂志. 2015(03)
[10]水中诺如病毒浓缩与应急检测研究[J]. 徐奋奋,蔡颖,黄亚琴,裘立晓,陈美芬,王滢滢. 中国卫生检验杂志. 2015(07)
本文编号：3025515
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MLPA基础探针构造Figure.1.1MLPAbasicprobeconstruction
25图 1.2 6 种猪腹泻病毒重组表达质粒Figure.1.2 Six porcine diarrhea virus recombinant expression plasmid1.6.1 E.coli 感受态细胞制备（1）准备适量的 1.5 mL 离心管，120℃高压灭菌后，放置烘箱 60℃烘干，置于-80℃冷藏备用。准备多个 250 mL 锥形离心管，自来水洗涤干净后，再用二级水冲洗干净，高压灭菌冷藏备用；（2）同时于-80℃冰箱中取 E.coli，在 LB 平板上划线复苏 E.coli，平板倒置于 37℃静置 12-16 h 培养；（3）从平板上挑出数个单个菌落接种于 10 mL 的 LB 液体培养基中，放入 37℃
品为阳性对照，正常的无菌水为阴性对照，对52份临性的PEDV病毒13份，疑似感染猪病毒性腹泻疾病小肠组泻疾病的鼻咽拭子38份）进行检测，对方法的检测结果时荧光定量PCR的检测方法及病毒鉴定分离结果进行比果准品的制备与验证中的6株病毒提取核酸，然后进行PCR扩增（见图1.3），，连接，转化，摇菌，提取质粒进行酶切和测序鉴定段的重组质粒，经多功能酶标仪测定浓度用无菌水进行×10-10ng /μL的质粒标准品。猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 张琪,徐丽美,周宏超,杨猛超,张淼涛,于三科,许信刚. 中国兽医科学. 2018(02)
[2]猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用[J]. 李苗,周关发,杨莹,张正学,王轶珊. 上海畜牧兽医通讯. 2017(06)
[3]多重连接探针扩增对5种牛病毒同步检测方法的建立[J]. 史喜菊,马贵平,柏亚铎,郝俊虎,乔彩霞,刘全国,李炎鑫,李冰玲. 中国兽医学报. 2017(02)
[4]猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 逄凤娇,张柏猛,何孔旺,俞正玉,徐向伟,郭容利,范宝超,温立斌,李彬,姜平. 畜牧与兽医. 2016(09)
[5]新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 张帆帆,宋德平,周信荣,黄冬艳,李安琪,彭棋,陈燕君,吴琼,何后军,唐玉新. 中国农业科学. 2016(07)
[6]国内首株猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus）的分离鉴定[J]. 陈建飞,王潇博,焦贺勋,时洪艳,张鑫,刘建波,石达,冯力. 中国预防兽医学报. 2016(03)
[7]食源性诺如病毒在果蔬农产品中的污染及检测研究[J]. 谢雅晶,刘贤金. 病毒学报. 2015(06)
[8]猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 张雪,杨倩,于红欣,王俊,孟凡伟,周双海. 中国兽医科学. 2015(06)
[9]检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较[J]. 李楠,王佳慧,李凤琴,徐进,江涛. 中国食品卫生杂志. 2015(03)
[10]水中诺如病毒浓缩与应急检测研究[J]. 徐奋奋,蔡颖,黄亚琴,裘立晓,陈美芬,王滢滢. 中国卫生检验杂志. 2015(07)
本文编号：3025515
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