合成绵羊抗菌肽NK-Lysin的生物学功能及其对雏鸡沙门氏菌感染的治疗研究

发布时间：2021-02-13 01:09

　　自然杀伤性细胞（NK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在机体免疫防御系统中与中性粒细胞、巨噬细胞一起发挥着至关重要的作用。抗菌肽NK-lysin存在于机体NK细胞和CTL细胞中，和人类的颗粒溶素（GNLY）是同源多肽，是天然免疫反应的主要组成部分，是连接适应性免疫反应和获得性免疫反应的纽带。近年来，抗生素药物的滥用使药物残留和细菌耐药性问题日益严重，严重威胁着畜牧业发展和人类健康，新型抗菌药物的研发成为迫切需要。抗菌肽成为新型抗菌药物研发的理想选择，在替代传统抗生素方面有着潜在的应用价值，具有广阔的市场前景。NK-Lysin的同源物颗粒溶素的研究已经进入临床阶段，而对NK-Lysin的功能和应用研究则较少。本研究探索绵羊NK-Lysin的原核表达方法，并分析其抗菌核心区域的结构和功能，通过化学合成绵羊抗菌肽NK-Lysin蛋白的主要功能多肽，检测合成多肽的抑菌谱和抑菌活性，利用雏鸡感染治疗模型验证绵羊抗菌肽对细菌感染的治疗作用，为绵羊抗菌肽NK-Lysin的功能研究和临床应用提供了科学资料。1、绵羊抗菌肽NK-Lysin的原核表达分析根据本实验室克隆的绵羊NK-Lysin基因GenBan... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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前言
第一章 文献综述
    1 抗菌肽的来源及分类
        1.1 天然抗菌肽
            1.1.1 微生物抗菌肽
            1.1.2 真菌抗菌肽
            1.1.3 植物抗菌肽
            1.1.4 动物抗菌肽
        1.2 化学合成抗菌肽
        1.3 基因工程抗菌肽
            1.3.1 大肠杆菌表达系统抗菌肽
            1.3.2 酵母表达系统抗菌肽
            1.3.3 枯草芽胞杆菌表达系统抗菌肽
            1.3.4 昆虫表达系统抗菌肽
        1.4 酶解法抗菌肽
        1.5 根据抗菌肽的结构分类
            1.5.1 α-螺旋结构抗菌肽
            1.5.2 β折叠结构抗菌肽
            1.5.3 无规则卷曲结构多肽
            1.5.4 Loop 环状结构抗菌肽
    2 抗菌肽的生物学功能及应用
        2.1 抗细菌活性
        2.2 抗真菌活性
        2.3 抗病毒活性
        2.4 抗肿瘤活性
        2.5 抗原虫活性
        2.6 免疫调节作用
        2.7 促进伤口愈合作用
    3 抗菌肽的抑菌机制及活性结构
        3.1 抗菌肽的抑菌机制
            3.1.1 细胞膜损伤机制
            3.1.2 细胞内损伤机制
        3.2 抗菌肽的活性结构
            3.2.1 抗菌肽的一级结构
            3.2.2 抗菌肽的α-螺旋结构
            3.2.3 抗菌肽的疏水性
            3.2.4 抗菌肽的两亲性
            3.2.5 抗菌肽的净电荷
    4 衍生抗菌肽分子的设计
        4.1 衍生抗菌肽分子的设计方法
            4.1.1 氨基酸序列修饰法
            4.1.2 活性结构优化法
            4.1.3 杂合抗菌肽法
    5 大肠杆菌表达系统
        5.1 大肠杆菌表达系统的构成
            5.1.1 目的基因
            5.1.2 表达载体
            5.1.3 表达宿主菌
        5.2 大肠杆菌表达系统的影响因素
            5.2.1 表达载体的种类
            5.2.2 目的基因的密码子
            5.2.3 mRNA 的稳定性
            5.2.4 诱导、培养条件
        5.3 pET 表达系统
    参考文献
第二章 实验部分
    实验一 绵羊 NK-Lysin 在大肠杆菌中的表达分析
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌株与载体
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 仪器
            1.2 方法
                1.2.1 引物设计与合成
                1.2.2 NK-Lysin-X 目的基因 PCR 扩增
                1.2.3 NK-Lysin-X 的 PCR 产物回收
                1.2.4 NK-Lysin-X 克隆载体的构建
                1.2.5 NK-Lysin-X 克隆载体的转化
                1.2.6 NK-Lysin-X 克隆载体鉴定
                1.2.7 NK-Lysin-X 原核表达载体的构建
                1.2.8 NK-Lysin-X 原核表达载体的鉴定
                1.2.9 NK-Lysin-X 在 DE3 中的诱导表达
        2 结果
            2.1 NK-Lysin-X 目的基因 PCR 扩增
            2.2 NK-Lysin-X 克隆载体菌液 PCR 鉴定
            2.3 NK-Lysin-X 克隆载体双酶切鉴定
            2.4 表达载体的双酶切
            2.5 NK-Lysin-X 原核表达载体的菌液 PCR 鉴定
            2.6 NK-Lysin-X 原核表达载体双酶切
            2.7 NK-Lysin-X 诱导表达的 SDS-PAGE 检测
        3 讨论
        参考文献
    实验二 绵羊抗菌肽 NK-Lysin 功能区的设计合成及其生物学功能研究
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 抗菌肽
                1.1.2 菌株与细胞系
                1.1.3 主要试剂
                1.1.4 仪器
            1.2 方法
                1.2.1 抗菌肽序列的选择和结构分析预测
                1.2.2 固体培养基径向扩散实验
                1.2.3 最小抑菌浓度测定
                1.2.4 合成多肽的抗肿瘤细胞活性
        2 结果
            2.0 合成多肽的序列及二级结构
            2.1 多肽的抑菌效果
            2.2 微量肉汤稀释法的 MIC 测定结果
            2.3 多肽对肿瘤细胞的杀伤作用
        3 讨论
        参考文献
    实验三 合成绵羊抗菌肽 NK559777-18、NK7652-23 对雏鸡沙门氏菌感染的治疗研究
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验材料
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 沙门氏菌的准备
                1.2.2 吸光度标准曲线的建立
                1.2.3 雏鸡沙门氏菌感染
                1.2.4 感染雏鸡的多肽治疗
                1.2.5 雏鸡沙门氏菌感染的病理学观察
        2 结果
            2.1 沙门氏菌数量与其吸光度标准曲线
            2.2 雏鸡感染沙门氏菌的临床症状
            2.3 多肽对雏鸡沙门氏菌攻毒的治疗效果
            2.4 雏鸡沙门氏菌感染后各器官的病理变化
        3 讨论
        参考文献
全文总结
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]浅谈鸡沙门氏菌病的综合防治[J]. 邢锦梅.  农技服务. 2014(02)
[2]抗菌肽的来源及应用[J]. 梁英.  动物营养学报. 2014(01)
[3]细菌内毒素的生物危害性及其拮抗剂研究进展[J]. 王红芳,李菁,王明霞.  河北医药. 2011(17)
[4]动物源性抗菌肽抗菌机理的研究进展[J]. 付登峰,胡建和,刘兴友.  黑龙江畜牧兽医. 2011(09)
[5]鸡源抗菌肽的研究进展及展望[J]. 赵军明,荣光,周汉林.  热带农业科学. 2011(03)
[6]禽类β-防御素的研究进展[J]. 洪胜辉,武艳军,龚道清.  中国饲料. 2010(22)
[7]细菌素的合成与作用机制[J]. 吴清平,黄静敏,张菊梅,莫树平.  微生物学通报. 2010(10)
[8]抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果研究[J]. 刘倚帆,徐良,朱海燕,张立可,汪以真.  动物营养学报. 2010(05)
[9]抗菌肽在抗肿瘤方面的研究进展[J]. 胡荣贵,李改瑞,陆家海.  实用肿瘤杂志. 2010(02)
[10]抗菌肽BuforinⅡ衍生物与大肠杆菌基因组DNA的作用机制[J]. 郝刚,施用晖,唐亚丽,乐国伟.  微生物学报. 2010(03)

博士论文
[1]BuforinⅡ抗菌肽的分子设计及对DNA作用抑菌机理研究[D]. 郝刚.江南大学 2009

硕士论文
[1]杂合抗菌肽CL23和LH28的分子设计与表达[D]. 董天堂.中国农业科学院 2008



本文编号：3031728