CSFV和PCV2感染后免疫抑制性受体转录水平研究及阻断猪PD-1/PD-L1通路多肽基序鉴定
发布时间：2021-02-13 02:44
免疫抑制性受体传递免疫抑制和免疫耐受信号,是获得性免疫调节的重要分子,包括程序性死亡因子1 （programmed death-1, PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 （cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）和淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3, LAG-3）等。多种慢性或持续性病毒感染过程中,PD-1、CTLA-4或LAG-3等过量表达,活化免疫负调节信号通路,引起免疫细胞凋亡、增殖能力降低以及抗病毒细胞因子分泌减少等,造成机体免疫功能损伤或免疫抑制,阻断PD-1、CTLA-4、LAG-3与其相应配体相互作用,可以逆转T细胞免疫功能。猪瘟（classical swine fever, CSF）和断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）是猪的两种重要传染性疾病,目前对CSF和PMWS引起免疫功能损伤或免疫抑制的致病机制已经从病原和宿主两方面进行了深入广泛的研究,但是,在宿主效应细胞免疫调节...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 免疫抑制性受体的研究进展
1.1 PD-1及其配体的发现和结构鉴定
1.2 PD-1/PD-Ls分子传导通路
1.3 PD-1和PD-Ls的表达和调节
1.4 PD-1/PD-L1通路与病毒感染
1.5 免疫抑制性受体CTLA-4和LAG-3的研究进展
1.6 猪免疫抑制性受体的研究进展
2. 猪瘟致病机制研究进展
2.1 猪瘟
2.2 猪瘟病毒
2.3 CSFV免疫致病机制
3. 断奶仔猪多系统衰竭综合征致病机制研究进展
3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
3.2 PMWS病原
3.3 PMWS免疫致病机制
4. 本课题研究目的与意义
第二章 猪感染CSFV后PD-1及其配体转录水平研究
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 病毒、细胞和试验动物
2.2 主要生物学试剂
2.3 主要溶液配制
2.4 主要仪器
50的测定"> 2.5 CSFV的繁殖及TCID50的测定
2.5.1 CSFV繁殖
50测定"> 2.5.2 CSFV TCID50测定
2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测目的基因mRNA方法的建立
2.6.1 引物设计与合成
2.6.2 PBMC分离
2.6.3 PBMCs中总RNA抽提
2.6.4 反转录合成cDNA
2.6.5 qPCR阳性标准品制备
2.6.6 qPCR标准曲线建立
2.7 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立
2.7.1 引物与探针的设计与合成
2.7.2 Taqman探针qPCR阳性标准品准备
2.7.3 Taqman探针qPCR标准曲线建立
2.7.4 敏感性试验
2.7.5 特异性试验
2.8 检测CSFV感染过程中PD-1与其配体转录水平及免疫效应变化
2.8.1 人工感染CSFV
2.8.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及其细胞因子IL-2和IL-10
2.8.3 qPCR结果分析
2.8.4 检测血浆中CSFV载量
2.8.5 T细胞增殖能力检测
3. 结果与分析
50的测定"> 3.1 CSFV鉴定与TCID50的测定
3.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及细胞因子IL-2、IL-10标准曲线的建立
3.3 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立
3.3.1 标准曲线的建立
3.3.2 敏感性
3.3.3 特异性
3.4 人工感染CSFV
3.5 感染CSFV过程中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA转录变化
3.6 感染CSFV过程中IL-2和IL-10 mRNA转录变化和T细胞增殖能力的检测
3.7 血浆中CSFV载量
4. 讨论
4.1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达
4.2 细胞因子IL-2和IL-10表达及T细胞增殖能力
4.3 CSFV载量
5. 小结
第三章 自然感染PCV2后免疫抑制性受体转录水平研究
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 主要生物学试剂
2.2 主要溶液配制
2.3 主要仪器设备
2.4 试验动物
2.5 qPCR引物设计与合成
2.6 qPCR检测目的基因方法的建立
2.7 自然PCV2感染过程中主要免疫抑制性受体及细胞因子转录水平研究
2.7.1 试验动物
2.7.2 PMWS的PCR病原检测
2.7.3 qPCR检测免疫抑制性受体和细胞因子转录水平
2.7.4 检测PBMCs增殖能力
3. 结果与分析
3.1 qPCR检测CTLA-4、LAG-3、PTEN及细胞因子IFN-γ标准曲线的建立
3.2 PMWS的病原检测
3.3 qPCR检测主要免疫抑制性受体的基因转录水平
3.4 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化
3.5 PBMCs增殖
4. 讨论
4.1 病原检测
4.2 PCV2感染后免疫抑制性受体和配体的表达
4.3 PCV2感染后细胞因子表达与PBMC增殖
5. 小结
第四章 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序鉴定
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 主要试剂及免疫动物
2.2 主要溶液配制
2.3 主要仪器设备
2.4 固相法合成多肽基本流程
2.5 多肽设计
2.6 固相法合成多肽程序
2.6.1 溶胀Rink amide-MBHA Resin树脂
2.6.2 多肽合成酰化程序
2.6.3 Kaiser法检测多肽合成缩合反应
2.6.4 脱保护基团
2.6.5 多肽合成重复程序
2.6.6 TFA法裂解多肽
2.6.7 合成多肽沉淀及脱盐纯化
2.6.8 鉴定合成多肽纯度及结构特性
2.7 多肽的溶解
2.8 多肽标记FITC
2.9 多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖能力
2.10 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合
2.11 FITC标记多肽与PBMC结合
2.12 多肽PD-15作为佐剂免疫效果评价
2.12.1 免疫小鼠
2.12.2 ELISA检测抗体水平
3. 结果与分析
3.1 多肽PD-15阻断后对PBMCs增殖影响
3.2 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1的结合
3.3 多肽PD-15与PBMCs结合
3.4 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列
3.5 多肽PD-15对体液免疫的影响
4. 讨论
4.1 固相多肽合成
4.2 多肽溶解
4.3 多肽阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖
4.5 PD-15作为免疫佐剂对抗体水平的影响
5. 小结
第五章 全文结论
参考文献
致谢
附录1 患PMWS断奶仔猪图片
博士期间发表论文及成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟国际流行态势、我国现状及防制对策[J]. 涂长春. 中国农业科学. 2003(08)
[2]我国猪瘟的流行病学现状分析[J]. 吕宗吉,涂长春,余兴龙,吴健敏,李月红,马刚,张茂林. 中国预防兽医学报. 2001(04)
[3]规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测和免疫效果分析[J]. 何启盖,陈焕春,吴斌,索绪峰,方六荣,汪超. 中国预防兽医学报. 2000(01)
博士论文
[1]猪程序性死亡因子1的克隆鉴定以及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对PD-1/PD-L通路的影响[D]. 彭金美.东北农业大学 2010
硕士论文
[1]猪瘟病毒感染靶细胞的配体表位研究[D]. 岳锋.河南科技学院 2010
本文编号：3031841
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 免疫抑制性受体的研究进展
1.1 PD-1及其配体的发现和结构鉴定
1.2 PD-1/PD-Ls分子传导通路
1.3 PD-1和PD-Ls的表达和调节
1.4 PD-1/PD-L1通路与病毒感染
1.5 免疫抑制性受体CTLA-4和LAG-3的研究进展
1.6 猪免疫抑制性受体的研究进展
2. 猪瘟致病机制研究进展
2.1 猪瘟
2.2 猪瘟病毒
2.3 CSFV免疫致病机制
3. 断奶仔猪多系统衰竭综合征致病机制研究进展
3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
3.2 PMWS病原
3.3 PMWS免疫致病机制
4. 本课题研究目的与意义
第二章 猪感染CSFV后PD-1及其配体转录水平研究
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 病毒、细胞和试验动物
2.2 主要生物学试剂
2.3 主要溶液配制
2.4 主要仪器
50的测定"> 2.5 CSFV的繁殖及TCID50的测定
2.5.1 CSFV繁殖
50测定"> 2.5.2 CSFV TCID50测定
2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测目的基因mRNA方法的建立
2.6.1 引物设计与合成
2.6.2 PBMC分离
2.6.3 PBMCs中总RNA抽提
2.6.4 反转录合成cDNA
2.6.5 qPCR阳性标准品制备
2.6.6 qPCR标准曲线建立
2.7 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立
2.7.1 引物与探针的设计与合成
2.7.2 Taqman探针qPCR阳性标准品准备
2.7.3 Taqman探针qPCR标准曲线建立
2.7.4 敏感性试验
2.7.5 特异性试验
2.8 检测CSFV感染过程中PD-1与其配体转录水平及免疫效应变化
2.8.1 人工感染CSFV
2.8.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及其细胞因子IL-2和IL-10
2.8.3 qPCR结果分析
2.8.4 检测血浆中CSFV载量
2.8.5 T细胞增殖能力检测
3. 结果与分析
50的测定"> 3.1 CSFV鉴定与TCID50的测定
3.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及细胞因子IL-2、IL-10标准曲线的建立
3.3 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立
3.3.1 标准曲线的建立
3.3.2 敏感性
3.3.3 特异性
3.4 人工感染CSFV
3.5 感染CSFV过程中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA转录变化
3.6 感染CSFV过程中IL-2和IL-10 mRNA转录变化和T细胞增殖能力的检测
3.7 血浆中CSFV载量
4. 讨论
4.1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达
4.2 细胞因子IL-2和IL-10表达及T细胞增殖能力
4.3 CSFV载量
5. 小结
第三章 自然感染PCV2后免疫抑制性受体转录水平研究
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 主要生物学试剂
2.2 主要溶液配制
2.3 主要仪器设备
2.4 试验动物
2.5 qPCR引物设计与合成
2.6 qPCR检测目的基因方法的建立
2.7 自然PCV2感染过程中主要免疫抑制性受体及细胞因子转录水平研究
2.7.1 试验动物
2.7.2 PMWS的PCR病原检测
2.7.3 qPCR检测免疫抑制性受体和细胞因子转录水平
2.7.4 检测PBMCs增殖能力
3. 结果与分析
3.1 qPCR检测CTLA-4、LAG-3、PTEN及细胞因子IFN-γ标准曲线的建立
3.2 PMWS的病原检测
3.3 qPCR检测主要免疫抑制性受体的基因转录水平
3.4 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化
3.5 PBMCs增殖
4. 讨论
4.1 病原检测
4.2 PCV2感染后免疫抑制性受体和配体的表达
4.3 PCV2感染后细胞因子表达与PBMC增殖
5. 小结
第四章 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序鉴定
1. 引言
2. 材料与方法
2.1 主要试剂及免疫动物
2.2 主要溶液配制
2.3 主要仪器设备
2.4 固相法合成多肽基本流程
2.5 多肽设计
2.6 固相法合成多肽程序
2.6.1 溶胀Rink amide-MBHA Resin树脂
2.6.2 多肽合成酰化程序
2.6.3 Kaiser法检测多肽合成缩合反应
2.6.4 脱保护基团
2.6.5 多肽合成重复程序
2.6.6 TFA法裂解多肽
2.6.7 合成多肽沉淀及脱盐纯化
2.6.8 鉴定合成多肽纯度及结构特性
2.7 多肽的溶解
2.8 多肽标记FITC
2.9 多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖能力
2.10 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合
2.11 FITC标记多肽与PBMC结合
2.12 多肽PD-15作为佐剂免疫效果评价
2.12.1 免疫小鼠
2.12.2 ELISA检测抗体水平
3. 结果与分析
3.1 多肽PD-15阻断后对PBMCs增殖影响
3.2 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1的结合
3.3 多肽PD-15与PBMCs结合
3.4 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列
3.5 多肽PD-15对体液免疫的影响
4. 讨论
4.1 固相多肽合成
4.2 多肽溶解
4.3 多肽阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖
4.5 PD-15作为免疫佐剂对抗体水平的影响
5. 小结
第五章 全文结论
参考文献
致谢
附录1 患PMWS断奶仔猪图片
博士期间发表论文及成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟国际流行态势、我国现状及防制对策[J]. 涂长春. 中国农业科学. 2003(08)
[2]我国猪瘟的流行病学现状分析[J]. 吕宗吉,涂长春,余兴龙,吴健敏,李月红,马刚,张茂林. 中国预防兽医学报. 2001(04)
[3]规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测和免疫效果分析[J]. 何启盖,陈焕春,吴斌,索绪峰,方六荣,汪超. 中国预防兽医学报. 2000(01)
博士论文
[1]猪程序性死亡因子1的克隆鉴定以及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对PD-1/PD-L通路的影响[D]. 彭金美.东北农业大学 2010
硕士论文
[1]猪瘟病毒感染靶细胞的配体表位研究[D]. 岳锋.河南科技学院 2010
本文编号：3031841
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