人工设计的核酸酶介导猪myostatin基因敲除的研究

发布时间：2021-02-17 14:57

　　背景：Myostatin基因为肌肉生长抑素基因,又称为生长／分化因子8（GDF8）,它属于TGF-β超家族的成员之一,该基因与肌肉的生长发育相关,是肌肉生长发育的负调控因子。在哺乳动物中,自然突变或者人工突变引起的myostatin基因失活都可以引发骨骼肌数量的增加,增加家畜产瘦肉的能力,从而提高家畜的生产性能,其为提高家畜生产效率的研究开辟了一条新的途径。人工敲除myostatin基因的方法有同源重组打靶、RNAi干扰和人工设计核酸酶切割三种方法,但同源重组打靶效率低、耗时长；携带siRNA的病毒载体随机插入引起机体功能紊乱的风险较高；而且以上两种方法都将向动物基因组中引入外源基因；人工设计核酸酶进行基因敲除不仅效率较高且极大的降低了引入外源基因的风险。人工设计核酸酶由可以识别并结合特定DNA序列的锌指蛋白和对DNA序列进行非特异切割的Fok I核酸酶组成,其对基因组进行切割时会产生DNA双链断裂（DSB）, DSB主要由细胞胞内两种修复机制进行修复----同源修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）,尤其是NHEJ在修复过程中往往会造成小片段的插入和缺失,造成遗传信息的丢失,从而... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：130 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语的中英文对照
第一部分 文献综述
    第一章 肌肉生长抑制素（MYOSTATIN）基因的研究进展
        1. MSTN基因的起源
        2. MSTN基因的结构
        3. MSTN基因的表达规律
        4. MSTN的生物学功能及其应用
            4.1 与肌肉组织的关系
            4.2 与脂肪组织的关系
            4.3 与其它组织的关系
        5. 结论
    第二章 锌指核酸酶在基因打靶中的应用
        1. 锌指核酸酶
            1.1 锌指蛋白
            1.2 FOKI切割域
        2. ZFNS介导基因敲除和插入
            2.1 DNA双链断裂的产生
            2.2 基因破坏
            2.3 依赖于同源性的基因组修饰
        3. 基因组修饰的特异性
            3.1 ZFNs系统的优化
            3.2 检测ZFNs的特异性
        4. ZFNS在治疗上的应用
            4.1 ZFNs在疾病治疗中的进展
            4.2 ZFNs治疗存在脱靶的问题
        5. 结论
    第三章 高效的基因组修饰工具-----TALEN
        1. TALES：新的DNA结合域
        2. TALENS对基因组的修饰
        3. TALENS的特异性及脱靶研究
        4. 结论
第二部分 实验研究
    第四章 ZFNS介导猪MYOSTATIN基因定点敲除的研究
        1 材料与仪器
            1.1 质粒及试剂
            1.2 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 靶向猪MYOSTATIN基因ZFNs的鉴定和体外转录
            2.2 注射编码ZFN蛋白的MRNA对猪孤雌胚发育的影响
            2.3 ZFN在猪卵母细胞中介导的MYOSTATIN基因敲除的研究
            2.4 ZFN在猪胎儿成纤维细胞中介导MYOSTATIN基因敲除的研究
        3 实验结果
            3.1 靶向猪MYOSTATIN基因的ZFN设计
            3.2 靶向MYOSTATIN基因的ZFNs活性验证
            3.3 ZFNs表达载体的鉴定及MRNA的体外转录
            3.4 注射MRNA对猪孤雌胚发育的影响
            3.5 MYOSTATIN基因突变检测引物的设计
            3.6 ZFNs介导的孤雌胚胎中MYOSTATIN基因突变的检测
            3.7 孤雌胚胎中MYOSTATIN基因的突变验证
            3.8 用T7核酸内切酶Ⅰ进行突变体的检测
            3.9 TA克隆测序检测
            3.10 ZFNs注射的猪孤雌胚胎的数据分析与统计
            3.11 细胞转染效率的对比
            3.12 ZFN蛋白的细胞定位
            3.13 ZFNs处理的PEF细胞中MYOSTATIN基因突变检测
            3.14 ZFN处理细胞的DNA序列分析
        4 讨论
            4.1 ZFNs的设计和传递形式
            4.2 卵母细胞的发育以及注射MRNA对猪孤雌胚发育的影响
            4.3 ZFNs在猪卵母细胞中介导的基因敲除
            4.4 ZFNS在PEF细胞中介导的MYOSTATIN基因的敲除
    第五章 TALENS介导猪MYOSTATIN基因定点敲除的研究
        1 材料与仪器
            1.1 质粒及试剂
            1.2 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 靶向猪MYOSTATIN基因TALENs的鉴定和体外转录
            2.2 猪胎儿成纤维细胞中TALENS的转染与效果检测
            2.3 猪孤雌激活胚的MRNA注射
            2.4 猪孤雌胚胎中TALENS注射的效果检测
        3 结果分析
            3.1 靶向猪MYOSTATIN基因TALEN的设计
            3.2 TALENs表达载体的鉴定及MRNA的体外转录
            3.3 TALENs蛋白的细胞定位
            3.4 TALENs处理的猪胎儿成纤维细胞中MYOSTATIN基因突变检测
            3.5 TALENs处理细胞的MYOSTATIN基因的TA克隆测序分析
            3.6 TALENs注射的猪孤雌胚胎中MYOSTATIN基因的突变检测
            3.7 TALENs处理的猪孤雌胚胎MYOSTATIN基因的TA克隆测序分析
        4 讨论
            4.1 TALEN的设计
            4.2 不同条件下TALEN的切割效率
            4.3 不同条件下突变的检测效率
            4.4 TALEN与ZFN在细胞和胚胎水平上切割活性的比较
全文结论
创新点
附录
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中与杂合子相伴产生的非目的条带的鉴定[J]. 王晓通,连林生,赵春江,邓学梅,吴常信.  农业生物技术学报. 2010(03)
[2]保存卵巢生理盐水温度的下降对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 蔡元,张兆旺,田见晖,成文敏,王金勇.  中国畜牧兽医文摘. 2006(01)
[3]猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析[J]. 邢凤英,吴中红,曾申明,刘国世,朱士恩,张忠诚,陈学进.  中国农业科学. 2004(01)
[4]培养过程中温度对猪卵母细胞发育的影响(脂滴部分)[J]. 姜国诚,秦鹏春.  东北农学院学报. 1990(01)



本文编号：3038145