水貂铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF/I在大肠杆菌中的高效表达与ELISA检测方法的建立
发布时间：2021-02-19 00:00
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌,广泛分布在自然界中,其感染的疾病类型多样化。致死率很高并且对多种抗生素具有耐药性,给临床治疗带来很大的困难。疫苗成为预防铜绿假单胞菌多种感染的有效方法。本研究根据已报道的铜绿假单胞菌OprF基因和铜绿假单胞菌OprI基因,利用融合PCR技术扩增两个片段的融合基因OprF190-342-OprI21–83进行原核表达,得到大小为25.2ku的融合蛋白,以此纯化蛋白为抗原建立了铜绿假单胞菌OprF/I蛋白间接ELISA方法。不同佐剂与纯化后OprF/I蛋白充分混合后免疫实验小鼠,检测小鼠血清中特异性抗体水平。主要研究内容如下:1.根据已报道的铜绿假单胞菌OprF基因（GenBank:JX040481.1）和OprI基因（GenBank:X58714.1）,利用PCR技术,分别克隆出OprF190-342、OprI21–83以及融合基因OprF190-342-OprI21–83,片段大小分别为495bp、207bp和663bp。2.铜绿假单胞菌外膜蛋白的原核表达及纯化。根据克隆的基因片段OprF、OprI、OprF/I...
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 铜绿假单胞菌概述
1.2 铜绿假单胞菌疫苗
1.2.1 灭活疫苗
1.2.2 减毒活疫苗
1.2.3 DNA疫苗
1.2.4 结合疫苗
1.3 免疫佐剂
1.3.1 矿物质类佐剂
1.3.2 弗氏佐剂
1.3.3 免疫刺激复合物及基质
1.3.4 细胞因子佐剂
1.3.5 多糖佐剂
1.3.6 人参皂苷佐剂
第二章 水貂铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF、OprI及OprF/I基因的克隆及表达
2.1 材料与方法
2.1.1 菌种与载体
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 引物设计及合成
2.1.5 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’的PCR扩增
2.1.6 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’ PCR产物的回收
2.1.7 基因片段OprF/I的PCR扩增
2.1.8 基因片段OprF/I PCR产物的回收
2.1.9 重组克隆质粒的构建
2.1.10 重组克隆质粒转化E.coli TransT1
2.1.11 重组克隆质粒的提取
2.1.12 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.1.13 重组克隆质粒的双酶切鉴定
2.1.14 重组克隆质粒的测序鉴定
2.1.15 重组表达质粒的构建
2.1.16 重组表达质粒转化E.coli Trans T1
2.1.17 重组表达质粒的提取
2.1.18 重组表达质粒的PCR鉴定
2.1.19 重组表达质粒的双酶切鉴定
2.1.20 重组表达质粒的测序鉴定
2.1.21 重组表达质粒转化BL21
2.1.22 重组表达质粒的提取与鉴定
2.2 结果与分析
2.2.1 基因片段OprF、OprI、OprF/I的扩增
2.2.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.2.3 重组克隆质粒的双酶切鉴定
2.2.4 重组克隆质粒的测序鉴定
2.2.5 重组表达质粒的PCR鉴定
2.2.6 重组表达质粒的双酶切鉴定
2.2.7 重组表达质粒的测序鉴定
2.3 讨论
2.4 本章小结
第三章 水貂铜绿假单胞菌外膜蛋白的原核表达及纯化
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的筛选
3.1.4 SDS-PAGE分析
3.1.5 OprF/I、OprF、OprI的大量表达
3.1.6 OprF/I、OprF、OprI的分离纯化
3.1.7 Western blot分析
3.2 结果与分析
3.2.1 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的研究
3.2.2 纯化产物OprF/I、OprF、OprI的SDS-PAGE分析
3.2.3 Western blot分析
3.3 讨论
3.4 本章小结
第四章 铜绿假单胞菌外膜蛋白及全菌间接ELISA方法的初步建立与比较
4.1 材料与方法
4.1.1 主要仪器
4.1.2 试验试剂
4.1.3 试验方法
4.2 结果与分析
4.2.1 抗原浓度测定
4.2.2 间接ELISA最佳反应条件
4.3 讨论
4.4 本章小结
第五章 铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF/I的免疫效果评价
5.1 材料与方法
5.1.1 试验仪器
5.1.2 主要试剂及实验动物
5.1.3 抗原制备
5.1.4 动物分组及免疫程序
5.1.5 小鼠血清的抗体检测
5.1.6 数据的统计与分析
5.2 结果与分析
5.3 讨论
5.4 本章小结
结论
参考文献
附录
作者简介
致谢
本文编号：3040293
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 铜绿假单胞菌概述
1.2 铜绿假单胞菌疫苗
1.2.1 灭活疫苗
1.2.2 减毒活疫苗
1.2.3 DNA疫苗
1.2.4 结合疫苗
1.3 免疫佐剂
1.3.1 矿物质类佐剂
1.3.2 弗氏佐剂
1.3.3 免疫刺激复合物及基质
1.3.4 细胞因子佐剂
1.3.5 多糖佐剂
1.3.6 人参皂苷佐剂
第二章 水貂铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF、OprI及OprF/I基因的克隆及表达
2.1 材料与方法
2.1.1 菌种与载体
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 引物设计及合成
2.1.5 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’的PCR扩增
2.1.6 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’ PCR产物的回收
2.1.7 基因片段OprF/I的PCR扩增
2.1.8 基因片段OprF/I PCR产物的回收
2.1.9 重组克隆质粒的构建
2.1.10 重组克隆质粒转化E.coli TransT1
2.1.11 重组克隆质粒的提取
2.1.12 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.1.13 重组克隆质粒的双酶切鉴定
2.1.14 重组克隆质粒的测序鉴定
2.1.15 重组表达质粒的构建
2.1.16 重组表达质粒转化E.coli Trans T1
2.1.17 重组表达质粒的提取
2.1.18 重组表达质粒的PCR鉴定
2.1.19 重组表达质粒的双酶切鉴定
2.1.20 重组表达质粒的测序鉴定
2.1.21 重组表达质粒转化BL21
2.1.22 重组表达质粒的提取与鉴定
2.2 结果与分析
2.2.1 基因片段OprF、OprI、OprF/I的扩增
2.2.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.2.3 重组克隆质粒的双酶切鉴定
2.2.4 重组克隆质粒的测序鉴定
2.2.5 重组表达质粒的PCR鉴定
2.2.6 重组表达质粒的双酶切鉴定
2.2.7 重组表达质粒的测序鉴定
2.3 讨论
2.4 本章小结
第三章 水貂铜绿假单胞菌外膜蛋白的原核表达及纯化
3.1 材料与方法
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的筛选
3.1.4 SDS-PAGE分析
3.1.5 OprF/I、OprF、OprI的大量表达
3.1.6 OprF/I、OprF、OprI的分离纯化
3.1.7 Western blot分析
3.2 结果与分析
3.2.1 重组原核表达质粒在大肠杆菌中最适表达条件的研究
3.2.2 纯化产物OprF/I、OprF、OprI的SDS-PAGE分析
3.2.3 Western blot分析
3.3 讨论
3.4 本章小结
第四章 铜绿假单胞菌外膜蛋白及全菌间接ELISA方法的初步建立与比较
4.1 材料与方法
4.1.1 主要仪器
4.1.2 试验试剂
4.1.3 试验方法
4.2 结果与分析
4.2.1 抗原浓度测定
4.2.2 间接ELISA最佳反应条件
4.3 讨论
4.4 本章小结
第五章 铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF/I的免疫效果评价
5.1 材料与方法
5.1.1 试验仪器
5.1.2 主要试剂及实验动物
5.1.3 抗原制备
5.1.4 动物分组及免疫程序
5.1.5 小鼠血清的抗体检测
5.1.6 数据的统计与分析
5.2 结果与分析
5.3 讨论
5.4 本章小结
结论
参考文献
附录
作者简介
致谢
本文编号：3040293
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