小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与绵羊CD46蛋白相互作用的初探
发布时间：2021-02-19 14:30
近年来PPRV跨地区、跨国界的传播,对全球防控PPR提出了严峻挑战。开展PPRV细胞受体的研究有助于探究PPRV的致病机理,对于该病的防控具有指导意义。与PPRV同属的人的病毒麻疹病毒受体的相关研究已经很深入,从文献了解到人的麻疹病毒的受体分别为CD46、Slam、Nectin4这三种。目前,已经证实PPRV与MV一样利用SLAM作为受体开启病毒的入侵,本论文旨在阐明CD46分子是否也做为PPRV的受体,开展了如下工作：1.采用3’/5’RACE方法从绵羊外周血淋巴细胞中首次克隆该基因,测序结果显示绵羊CD46含有七种不同的可变剪切形式。构建重组表达载体pCMV-Myc/CD46并在CHO-K1细胞中高效表达,经、Vestern blotting分析CD46蛋白表达良好,片段大小与预期符合。2.取编号CD46a基因进行常规生物信息学分析。结果表明,绵羊CD46a的cDNA序列开放阅读框长1083bp,编码由360个氨基酸残基组成的多肽,该多肽分子质量理论值为39ku,理论等电点为6.5。对该蛋白结构分析发现绵羊CD46a第1-42位氨基酸残基为信号肽序列共有5处N糖基化位点,4处蛋白激...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小反自兽疫病毒基因组结构图
中国农业科学院硕士学位论文 第二章绵羊CD46基因的克隆与表达收集该层细胞，沉淀经反复洗2次即得所需淋巴细胞.然后加TRIzol试剂，按照TRIzoH?式剂盒说明书抽提细胞总RNA。RNA提取过程中加入DNA酶消化处理，使用紫外分光光度计NanoDrop 2000测定RNA的A280和A260以计算总RNA的浓度，将其放入-80°C备用。2.2.2绵羊CD46基因的f广增根据GenBank中收录的绵羊CD46基因的两条部分序列预测信息（XMJ)04013924.1，XM_004013923.1),与人的CD46进行序列比对搜索到保守序列设计2条引物（分别命名为CD46UP,CD46DN),以提取的绵羊总RNA为模板扩增该保守序列。获得的序列经NCBI Blast证实其为绵羊CD46部分序列。然后根据扩增获得的绵羊的CD46基因部分序列，设计5 'RACE和3’RACE需要的特异性引物GSP1和GSP2，巢式PCR鉴定引物NGSP1和NGSP2;将375’RACE片段及上述获得的CD46部分序列拼接得到全长基因，然后根据该基因序列设计扩增绵羊CD46完整cDNA片段的引物CD46~cDNA-F和CD46~cDNA-R,引物设计策略如图2.1所示，引物序列见表2.1。
扩增片段均与己知CD46序列有重叠区域，经blast和序列拼接分析得到全长基因，扩增产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小与预期扩增片段基本一致，约为1500bp (见图2.2)，经测序证实为绵羊的CD46基因。M 1lOOObp 资露5 ■ +〒::. ■‘ 1750bp『^SOObp ‘ ‘ “ 1250bploobp r ’ ^ 4图2.2绵羊CD46基因的RT-PCR丨广增MDL2000Marker; 1 .PCR 产物。Fi^.2 RT-PCR amplification of CD46 gene of sheepMDL2000Marker; I. PCR product.2.3.2绵羊CD46基因序列分析pGEM-T easy载体的测序结果显示，绵羊CD46基因存在七种可变剪切形式，将其命名为CD46a-g,使用ORF Finder找到CD46的7个剪切体的幵放阅读框序列。2.3.3 pCMV/Myc/CD46a-g重组表达载体的构建与鉴定将CD46a-g扩增产物经EcoRI、Kpn I双酶切后，与经过同样双酶切的载体进行连接，构建重组表达载体。构建的重组质粒经双酶切后，出现大小与目的片段相一致的特异条带（见图2.3)，说明重组表达载体构建成功。经测序鉴定，CD46a-g七个不同剪切形式的ORF成功插入到表达载体pCMV/Myc中
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒疫苗[J]. 陈伟业,曲林茂,胡森,胡倩倩,张倩,支海兵,黄克和,步志高. 生物工程学报. 2009(04)
[2]我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析[J]. 包静月,王志亮,李林,赵文姬,索朗次仁,李金明,王英丽,吴晓东,刘春菊,刘雨田,于小静,杨咏梅. 病毒学报. 2008(06)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的装配与释放研究[D]. 王秋霞.中国农业科学院 2013
[2]小反刍兽疫病毒全长cDNA的构建及DNA疫苗的免疫学研究[D]. 翟军军.中国农业科学院 2012
本文编号：3041251
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小反自兽疫病毒基因组结构图
中国农业科学院硕士学位论文 第二章绵羊CD46基因的克隆与表达收集该层细胞，沉淀经反复洗2次即得所需淋巴细胞.然后加TRIzol试剂，按照TRIzoH?式剂盒说明书抽提细胞总RNA。RNA提取过程中加入DNA酶消化处理，使用紫外分光光度计NanoDrop 2000测定RNA的A280和A260以计算总RNA的浓度，将其放入-80°C备用。2.2.2绵羊CD46基因的f广增根据GenBank中收录的绵羊CD46基因的两条部分序列预测信息（XMJ)04013924.1，XM_004013923.1),与人的CD46进行序列比对搜索到保守序列设计2条引物（分别命名为CD46UP,CD46DN),以提取的绵羊总RNA为模板扩增该保守序列。获得的序列经NCBI Blast证实其为绵羊CD46部分序列。然后根据扩增获得的绵羊的CD46基因部分序列，设计5 'RACE和3’RACE需要的特异性引物GSP1和GSP2，巢式PCR鉴定引物NGSP1和NGSP2;将375’RACE片段及上述获得的CD46部分序列拼接得到全长基因，然后根据该基因序列设计扩增绵羊CD46完整cDNA片段的引物CD46~cDNA-F和CD46~cDNA-R,引物设计策略如图2.1所示，引物序列见表2.1。
扩增片段均与己知CD46序列有重叠区域，经blast和序列拼接分析得到全长基因，扩增产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小与预期扩增片段基本一致，约为1500bp (见图2.2)，经测序证实为绵羊的CD46基因。M 1lOOObp 资露5 ■ +〒::. ■‘ 1750bp『^SOObp ‘ ‘ “ 1250bploobp r ’ ^ 4图2.2绵羊CD46基因的RT-PCR丨广增MDL2000Marker; 1 .PCR 产物。Fi^.2 RT-PCR amplification of CD46 gene of sheepMDL2000Marker; I. PCR product.2.3.2绵羊CD46基因序列分析pGEM-T easy载体的测序结果显示，绵羊CD46基因存在七种可变剪切形式，将其命名为CD46a-g,使用ORF Finder找到CD46的7个剪切体的幵放阅读框序列。2.3.3 pCMV/Myc/CD46a-g重组表达载体的构建与鉴定将CD46a-g扩增产物经EcoRI、Kpn I双酶切后，与经过同样双酶切的载体进行连接，构建重组表达载体。构建的重组质粒经双酶切后，出现大小与目的片段相一致的特异条带（见图2.3)，说明重组表达载体构建成功。经测序鉴定，CD46a-g七个不同剪切形式的ORF成功插入到表达载体pCMV/Myc中
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒疫苗[J]. 陈伟业,曲林茂,胡森,胡倩倩,张倩,支海兵,黄克和,步志高. 生物工程学报. 2009(04)
[2]我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析[J]. 包静月,王志亮,李林,赵文姬,索朗次仁,李金明,王英丽,吴晓东,刘春菊,刘雨田,于小静,杨咏梅. 病毒学报. 2008(06)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的装配与释放研究[D]. 王秋霞.中国农业科学院 2013
[2]小反刍兽疫病毒全长cDNA的构建及DNA疫苗的免疫学研究[D]. 翟军军.中国农业科学院 2012
本文编号：3041251
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