新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建及TNF-α相关基因的筛选
发布时间：2021-02-21 00:10
为了研究卡拉库尔羊外周血淋巴细胞与TNF-α相关基因的结构、功能,本研究成功提取了卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA并鉴定了 RNA的完整性,利用Smart cDNA文库构建试剂盒成功构建了卡拉库尔羊的外周血淋巴细胞cDNA文库。用地高辛标记的TNF-α探针从cDNA文库中筛选与TNF-α相关的基因,并对筛选结果进行了分析。首先,采取健康卡羊的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,鉴定总RNA的质量和测定总RNA的浓度后,经逆转录合成cDNA的第一链和第二链DNA后,用蛋白酶K和cDNA片段用C HROMA SPIN-400柱离心分离纯化,与λTriplEx2 Vector载体连接后用包装蛋白Gigapack III Go 1d Packing Extract对连接产物进行包装,构建cDNA文库,测定初始文库滴度和扩增文库滴度。结果表明:正常卡拉库尔羊外周血淋巴细胞cDNA文库的原始库容量为1.67×106pfu/ml,扩增文库的滴度为3.3×109pfu/ml,实验结果表明本实验所构建的cDNA文库容量符合文库构建的标准。其次,采用地高辛标记试剂盒标记了 TNF-α探针,并对探针的标记效...
【文章来源】：塔里木大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１卡拉库尔羊外周血淋巴细胞分离图谱（１：离心前；２：离心后）??Ｆｉｇ．ｌ?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｓｅｐａｒａｔｅ?（?１：?Ｐｒｉｏｒ?ｔｏ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；?２：?Ａｆｔｅｒ?ｔｈｅ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）??
２．２．２新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总ＲＮＡ的提取??从新疆卡拉库尔卞外周Ｉｆｌｌ．淋巴细胞中提取得到总ＲＮＡ，用０．８?％琼脂糖凝胶电泳对提取的总??ＲＮＡ进行完整性的鉴定（见图２），图中我们可以看到三条带，从上到下依次是２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ?ＲＮＡ，??总ＲＮＡ没有被污染，纯度较高，质景较好。??Ｍ?ｔ?２??ＨＢＫ！：：?—－：ｓ＊??５Ｉ＊??通＿＿＿＿＿＿?ｉ?ｉ?．??图２卡拉库尔羊淋巴细胞总ＲＮＡ基因电泳图谱??Ｆｉｇ．２?ｋａｌａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍ：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）；泳道１，２：总ＲＮＡ基因??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；?ｌａｎｅｓ?１，１：?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ??２２??
２．２．４?ｃＤＮＡ第二链合成ＰＣＲ结果鉴定??ｍＲＮＡ经第一链合成后再经ＰＣＲ合成第二链，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见??ｄｓＤＮ?Ａ形成弥散条带在０．卜４ｋｂ之间。结采如图３：??ＩＩ?１?１２??３０－Ｘｂｐ?—??２０００ｂ〇￣＾—?２０〇〇ｂｐ??ｌＯＯＣｂｐ—＾——ｌＯＯＯｂｐ??＾?７５０ｂｐ??＾?５００ｂｐ??＾?２５０ｂｔ＞??＾—ｌＯＯｂｐ??图３卡拉库尔羊淋巴细胞ｄｓＤＮＡ电泳图谱??Ｍ１：?ＤＮＡ分子量标准（１Ｋｂ）?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇ．３?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌＫｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??２．２．５?ｄ）ＮＡ初始文库的滴度测定??取初始文库稀释为ｌＯ＇ｌＯ—２，丨Ｏ—ＭＯ＂４各ＩｐＬ加ＺＯＯＨＬＸＬｉ－Ｂｌｕｅ?（ＯＤｓｏｏＨ．Ｏ）铀板，４２Ｃ孵育过??夜后取出平皿，汁数噬菌斑的数最，１０“为１６７个，１０－２为１６个，１０－３为２个。用１０－１汁兑出初始文库的??滴度为丨．６７ｘ?１?〇６个／ｍ丨
【参考文献】：
期刊论文
[1]卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化[J]. 贺艳艳,潘辉,王娟娟,左文斌,李莲瑞. 湖北农业科学. 2013(07)
[2]地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化[J]. 周长发,张锐,张晓,罗淑萍,郭三堆. 中国农业科技导报. 2009(04)
[3]胸腺素β4和β10及β15在乳腺癌中的表达及意义[J]. 兰海燕. 中国肿瘤临床与康复. 2009(01)
[4]地高辛核酸探针的制备及研究进展[J]. 王易振. 中国医药指南. 2008(18)
[5]西洋参cDNA文库构建及表达序列标签（EST）分析[J]. 陈士林,孙永巧,宋经元,李滢,李晨吉,胡松年,李西文,姚辉,张晓伟. 药学学报. 2008(06)
[6]新疆卡拉库尔羊的研究现状及前景[J]. 李莲瑞,陈根元,王晓斌,赵津子,李霞,代小芳. 中国草食动物. 2008(02)
[7]RNA的提取及3种RNA提取试剂盒的比较[J]. 曹建斌. 科技情报开发与经济. 2008(10)
[8]犬贾第虫端粒重复序列的Southern印迹杂交分析[J]. 刘成武,张西臣,李建华,刘慧,宫鹏涛,张国才. 中国病原生物学杂志. 2008(03)
[9]奶山羊乳房炎及其疫苗免疫的免疫学变化[J]. 齐琳,李庆章. 畜牧兽医科技信息. 2008(01)
[10]转Bt+Sck棉花的分子检测及其农艺性状分析[J]. 郭金英,郭旺珍,朱协飞,朱祯,张天真. 南京农业大学学报. 2007(03)
博士论文
[1]鲤鱼（Cyprinus carpio L.）外周血白细胞cDNA文库的构建和差异表达基因的筛选[D]. 李莲瑞.吉林大学 2006
硕士论文
[1]新疆卡拉库尔羊TNF-α基因的克隆、原核表达及抗原性分析[D]. 贺艳艳.塔里木大学 2012
[2]新疆卡拉库尔羊Fas基因的克隆、原核表达及抗原性分析[D]. 潘辉.塔里木大学 2012
[3]重组人肿瘤坏死因子（rhTNF-α）在大肠杆菌中的摇瓶表达、复性与同时纯化[D]. 任文轩.西北大学 2009
[4]巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及筛选[D]. 张建哲.上海师范大学 2008
[5]黑鲷肿瘤坏死因子cDNA的克隆与体外表达的研究[D]. 高春萍.中国海洋大学 2004
本文编号：3043556
【文章来源】：塔里木大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１卡拉库尔羊外周血淋巴细胞分离图谱（１：离心前；２：离心后）??Ｆｉｇ．ｌ?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｓｅｐａｒａｔｅ?（?１：?Ｐｒｉｏｒ?ｔｏ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；?２：?Ａｆｔｅｒ?ｔｈｅ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）??
２．２．２新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总ＲＮＡ的提取??从新疆卡拉库尔卞外周Ｉｆｌｌ．淋巴细胞中提取得到总ＲＮＡ，用０．８?％琼脂糖凝胶电泳对提取的总??ＲＮＡ进行完整性的鉴定（见图２），图中我们可以看到三条带，从上到下依次是２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ?ＲＮＡ，??总ＲＮＡ没有被污染，纯度较高，质景较好。??Ｍ?ｔ?２??ＨＢＫ！：：?—－：ｓ＊??５Ｉ＊??通＿＿＿＿＿＿?ｉ?ｉ?．??图２卡拉库尔羊淋巴细胞总ＲＮＡ基因电泳图谱??Ｆｉｇ．２?ｋａｌａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍ：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）；泳道１，２：总ＲＮＡ基因??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；?ｌａｎｅｓ?１，１：?ｒＲＮＡ?ｇｅｎｅ??２２??
２．２．４?ｃＤＮＡ第二链合成ＰＣＲ结果鉴定??ｍＲＮＡ经第一链合成后再经ＰＣＲ合成第二链，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见??ｄｓＤＮ?Ａ形成弥散条带在０．卜４ｋｂ之间。结采如图３：??ＩＩ?１?１２??３０－Ｘｂｐ?—??２０００ｂ〇￣＾—?２０〇〇ｂｐ??ｌＯＯＣｂｐ—＾——ｌＯＯＯｂｐ??＾?７５０ｂｐ??＾?５００ｂｐ??＾?２５０ｂｔ＞??＾—ｌＯＯｂｐ??图３卡拉库尔羊淋巴细胞ｄｓＤＮＡ电泳图谱??Ｍ１：?ＤＮＡ分子量标准（１Ｋｂ）?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇ．３?ｋａｒａｋｕｌ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａｌ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌＫｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??２．２．５?ｄ）ＮＡ初始文库的滴度测定??取初始文库稀释为ｌＯ＇ｌＯ—２，丨Ｏ—ＭＯ＂４各ＩｐＬ加ＺＯＯＨＬＸＬｉ－Ｂｌｕｅ?（ＯＤｓｏｏＨ．Ｏ）铀板，４２Ｃ孵育过??夜后取出平皿，汁数噬菌斑的数最，１０“为１６７个，１０－２为１６个，１０－３为２个。用１０－１汁兑出初始文库的??滴度为丨．６７ｘ?１?〇６个／ｍ丨
【参考文献】：
期刊论文
[1]卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化[J]. 贺艳艳,潘辉,王娟娟,左文斌,李莲瑞. 湖北农业科学. 2013(07)
[2]地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化[J]. 周长发,张锐,张晓,罗淑萍,郭三堆. 中国农业科技导报. 2009(04)
[3]胸腺素β4和β10及β15在乳腺癌中的表达及意义[J]. 兰海燕. 中国肿瘤临床与康复. 2009(01)
[4]地高辛核酸探针的制备及研究进展[J]. 王易振. 中国医药指南. 2008(18)
[5]西洋参cDNA文库构建及表达序列标签（EST）分析[J]. 陈士林,孙永巧,宋经元,李滢,李晨吉,胡松年,李西文,姚辉,张晓伟. 药学学报. 2008(06)
[6]新疆卡拉库尔羊的研究现状及前景[J]. 李莲瑞,陈根元,王晓斌,赵津子,李霞,代小芳. 中国草食动物. 2008(02)
[7]RNA的提取及3种RNA提取试剂盒的比较[J]. 曹建斌. 科技情报开发与经济. 2008(10)
[8]犬贾第虫端粒重复序列的Southern印迹杂交分析[J]. 刘成武,张西臣,李建华,刘慧,宫鹏涛,张国才. 中国病原生物学杂志. 2008(03)
[9]奶山羊乳房炎及其疫苗免疫的免疫学变化[J]. 齐琳,李庆章. 畜牧兽医科技信息. 2008(01)
[10]转Bt+Sck棉花的分子检测及其农艺性状分析[J]. 郭金英,郭旺珍,朱协飞,朱祯,张天真. 南京农业大学学报. 2007(03)
博士论文
[1]鲤鱼（Cyprinus carpio L.）外周血白细胞cDNA文库的构建和差异表达基因的筛选[D]. 李莲瑞.吉林大学 2006
硕士论文
[1]新疆卡拉库尔羊TNF-α基因的克隆、原核表达及抗原性分析[D]. 贺艳艳.塔里木大学 2012
[2]新疆卡拉库尔羊Fas基因的克隆、原核表达及抗原性分析[D]. 潘辉.塔里木大学 2012
[3]重组人肿瘤坏死因子（rhTNF-α）在大肠杆菌中的摇瓶表达、复性与同时纯化[D]. 任文轩.西北大学 2009
[4]巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及筛选[D]. 张建哲.上海师范大学 2008
[5]黑鲷肿瘤坏死因子cDNA的克隆与体外表达的研究[D]. 高春萍.中国海洋大学 2004
本文编号：3043556
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