检测猪肺表面活性蛋白A/D基因实时荧光定量和纳米PCR方法的建立
发布时间：2021-02-23 07:41
表面活性蛋白A（surfactant proteins，SP-A）和表面活性蛋白D（surfactant proteins，SP-D）对肺部的发育、成熟起到重要作用。SP-A和SP-D基因的表达量与呼吸系统免疫防御息息相关，对肺部的异常病变具有指示作用，所以可以作为多种肺部疾病的生物标记。为检测体内SP-A/SP-D基因，本研究建立了两种检测方法：即荧光定量PCR方法和纳米金PCR方法，并且验证这两种方法的特异性及灵敏性。根据猪SP-A基因序列（NM214265.1）和猪SP-D基因序列（NM214110）设计特异性引物，将SP-A的CDS区（750bp）和SP-D的CDS区（1137bp）分别链接至PMD-18T载体，构建了猪SP-A基因和SP-D基因CDS区全序列重组质粒PMD-SP-A和PMD-SP-D。设计并合成了特异性的引物和探针，以重组质粒为标准品，对探针、引物等浓度及退火温度进行优化，建立了猪SP-A/SP-D基因的TaqMan荧光定量PCR方法。实验结果显示：所建立荧光定量PCR检测方法为异性扩增；SP-A基因检测下限达到2....
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：40 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SP-A肽链结构
1.3.1 SP-A/SP-D 基因的生物学特性SP-A 肽链是由 248 个氨基酸组成的，共 750bp，分子量约为 28-36kDa[6]。SP-A 每链都有四个基本结构[20]（图 1.1）：一个短的含有半胱氨酸残基的 N 端；胶原样区（CL茎区；球状结构的 C 型糖识别区（CRD）。CLR 区能使三条肽链螺旋链接在一起，茎区着球状的 CRD 区，构成了由三条肽链组成的三聚体结构（图 1.2）。而 SP-A 蛋白是由六样的三聚体，在 N-端通过半胱氨酸残基链接而成的一束（图 1.3）。SP-A 的 CLR 区高度保决定着蛋白的三聚体结构，CRD 区有糖的识别位点，在 Ca2+的存在下，CRD 区能够与合，这一特性是 SP-A 能够结合外源微生物促进免疫反应的结构基础。SP-A 的 CLR 和 都属于 C 型胶原凝集素[21]，CRD 在 Ca2+依赖的情况下结合糖基，同时 CLR 结合受体，参与呼吸系统的免疫防御反应，而不需要中央免疫系统的调节。图 1.1 SP-A 肽链结构Fig1.1 The Peptide chain structure of SP-A
1.3.1 SP-A/SP-D 基因的生物学特性SP-A 肽链是由 248 个氨基酸组成的，共 750bp，分子量约为 28-36kDa[6]。SP-A 每链都有四个基本结构[20]（图 1.1）：一个短的含有半胱氨酸残基的 N 端；胶原样区（CL茎区；球状结构的 C 型糖识别区（CRD）。CLR 区能使三条肽链螺旋链接在一起，茎区着球状的 CRD 区，构成了由三条肽链组成的三聚体结构（图 1.2）。而 SP-A 蛋白是由六样的三聚体，在 N-端通过半胱氨酸残基链接而成的一束（图 1.3）。SP-A 的 CLR 区高度保决定着蛋白的三聚体结构，CRD 区有糖的识别位点，在 Ca2+的存在下，CRD 区能够与合，这一特性是 SP-A 能够结合外源微生物促进免疫反应的结构基础。SP-A 的 CLR 和 都属于 C 型胶原凝集素[21]，CRD 在 Ca2+依赖的情况下结合糖基，同时 CLR 结合受体，参与呼吸系统的免疫防御反应，而不需要中央免疫系统的调节。图 1.1 SP-A 肽链结构Fig1.1 The Peptide chain structure of SP-A
【参考文献】：
期刊论文
[1]北京城区可吸入颗粒物分布与呼吸系统疾病相关分析[J]. 杨维,赵文吉,宫兆宁,赵文慧,唐涛. 环境科学. 2013(01)
[2]猪常见呼吸道疾病的鉴别诊断及防治[J]. 徐博文,代军,张阳,杨启帆,刘丹,舒蕾. 山东畜牧兽医. 2012(08)
[3]猪呼吸系统疾病特点及防治[J]. 黄丹. 福建农业. 2012(08)
[4]纳米PCR技术检测溶藻弧菌的建立与初步应用[J]. 刘阳,孔繁德,彭小莉,徐淑菲,吴德峰,林立. 中国动物检疫. 2012(03)
[5]西安市雁塔区冬季可吸入颗粒物时空变化研究[J]. 穆珍珍,赵景波,徐娜,姚兰,李雨霞,孟静静. 环境科学学报. 2011(07)
[6]肺表面活性蛋白D的研究进展[J]. 卫阔,宋兴磊,闫亚敏. 国际病理科学与临床杂志. 2011(03)
[7]纳米银对PCR体系中DNA合成的影响及其机理研究[J]. 刘鹏鹏,关荣发,刘明启,黄光荣,戴贤君. 农业生物技术学报. 2010(05)
[8]猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 乔莉娟,王立贤,颜华. 动物医学进展. 2009(08)
[9]纳米金增强复杂体系中PCR扩增低拷贝基因的反应特异性初步研究[J]. 李海阔,曹雪雁,周智磊,陈恒. 中国生物工程杂志. 2009(08)
[10]肺表面活性物质相关蛋白A的研究进展[J]. 晋大鹏,王立贤,张龙超,陈书明,胡志帅. 中国畜牧兽医. 2009(04)
博士论文
[1]猪肺免疫防御相关基因—肺表面活性蛋白A的研究[D]. 乔莉娟.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]猪细小病毒感染ST细胞对I型干扰素产生的影响[D]. 蔺文成.中国农业科学院 2012
[2]荣昌猪肺表面活性蛋白A分子生物学研究[D]. 刘欣.中国农业科学院 2010
[3]肺表面活性物质相关蛋白A1在大肠杆菌及酵母中的表达与纯化[D]. 兰和魁.第一军医大学 2000
本文编号：3047242
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：40 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SP-A肽链结构
1.3.1 SP-A/SP-D 基因的生物学特性SP-A 肽链是由 248 个氨基酸组成的，共 750bp，分子量约为 28-36kDa[6]。SP-A 每链都有四个基本结构[20]（图 1.1）：一个短的含有半胱氨酸残基的 N 端；胶原样区（CL茎区；球状结构的 C 型糖识别区（CRD）。CLR 区能使三条肽链螺旋链接在一起，茎区着球状的 CRD 区，构成了由三条肽链组成的三聚体结构（图 1.2）。而 SP-A 蛋白是由六样的三聚体，在 N-端通过半胱氨酸残基链接而成的一束（图 1.3）。SP-A 的 CLR 区高度保决定着蛋白的三聚体结构，CRD 区有糖的识别位点，在 Ca2+的存在下，CRD 区能够与合，这一特性是 SP-A 能够结合外源微生物促进免疫反应的结构基础。SP-A 的 CLR 和 都属于 C 型胶原凝集素[21]，CRD 在 Ca2+依赖的情况下结合糖基，同时 CLR 结合受体，参与呼吸系统的免疫防御反应，而不需要中央免疫系统的调节。图 1.1 SP-A 肽链结构Fig1.1 The Peptide chain structure of SP-A
1.3.1 SP-A/SP-D 基因的生物学特性SP-A 肽链是由 248 个氨基酸组成的，共 750bp，分子量约为 28-36kDa[6]。SP-A 每链都有四个基本结构[20]（图 1.1）：一个短的含有半胱氨酸残基的 N 端；胶原样区（CL茎区；球状结构的 C 型糖识别区（CRD）。CLR 区能使三条肽链螺旋链接在一起，茎区着球状的 CRD 区，构成了由三条肽链组成的三聚体结构（图 1.2）。而 SP-A 蛋白是由六样的三聚体，在 N-端通过半胱氨酸残基链接而成的一束（图 1.3）。SP-A 的 CLR 区高度保决定着蛋白的三聚体结构，CRD 区有糖的识别位点，在 Ca2+的存在下，CRD 区能够与合，这一特性是 SP-A 能够结合外源微生物促进免疫反应的结构基础。SP-A 的 CLR 和 都属于 C 型胶原凝集素[21]，CRD 在 Ca2+依赖的情况下结合糖基，同时 CLR 结合受体，参与呼吸系统的免疫防御反应，而不需要中央免疫系统的调节。图 1.1 SP-A 肽链结构Fig1.1 The Peptide chain structure of SP-A
【参考文献】：
期刊论文
[1]北京城区可吸入颗粒物分布与呼吸系统疾病相关分析[J]. 杨维,赵文吉,宫兆宁,赵文慧,唐涛. 环境科学. 2013(01)
[2]猪常见呼吸道疾病的鉴别诊断及防治[J]. 徐博文,代军,张阳,杨启帆,刘丹,舒蕾. 山东畜牧兽医. 2012(08)
[3]猪呼吸系统疾病特点及防治[J]. 黄丹. 福建农业. 2012(08)
[4]纳米PCR技术检测溶藻弧菌的建立与初步应用[J]. 刘阳,孔繁德,彭小莉,徐淑菲,吴德峰,林立. 中国动物检疫. 2012(03)
[5]西安市雁塔区冬季可吸入颗粒物时空变化研究[J]. 穆珍珍,赵景波,徐娜,姚兰,李雨霞,孟静静. 环境科学学报. 2011(07)
[6]肺表面活性蛋白D的研究进展[J]. 卫阔,宋兴磊,闫亚敏. 国际病理科学与临床杂志. 2011(03)
[7]纳米银对PCR体系中DNA合成的影响及其机理研究[J]. 刘鹏鹏,关荣发,刘明启,黄光荣,戴贤君. 农业生物技术学报. 2010(05)
[8]猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 乔莉娟,王立贤,颜华. 动物医学进展. 2009(08)
[9]纳米金增强复杂体系中PCR扩增低拷贝基因的反应特异性初步研究[J]. 李海阔,曹雪雁,周智磊,陈恒. 中国生物工程杂志. 2009(08)
[10]肺表面活性物质相关蛋白A的研究进展[J]. 晋大鹏,王立贤,张龙超,陈书明,胡志帅. 中国畜牧兽医. 2009(04)
博士论文
[1]猪肺免疫防御相关基因—肺表面活性蛋白A的研究[D]. 乔莉娟.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]猪细小病毒感染ST细胞对I型干扰素产生的影响[D]. 蔺文成.中国农业科学院 2012
[2]荣昌猪肺表面活性蛋白A分子生物学研究[D]. 刘欣.中国农业科学院 2010
[3]肺表面活性物质相关蛋白A1在大肠杆菌及酵母中的表达与纯化[D]. 兰和魁.第一军医大学 2000
本文编号：3047242
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