CDV感染Mv.1.Lu细胞的蛋白质组学分析及TLR3对CDV复制增殖的影响研究
发布时间：2021-02-26 04:02
犬瘟热病毒（CDV）感染引起的犬瘟热（CD）是水貂致死性疾病中的主要传染病之一,给水貂养殖业带来了严重的经济损失。该病没有有效的治疗方法,主要通过疫苗免疫进行预防,但是越来越多的文献表明,免疫过疫苗的动物仍能够发病。如何有效防控CDV感染一直是研究者们关注的热点。病毒与宿主之间的相互平衡和制约决定了疾病进程和转归,因此更好的了解病毒-宿主之间相互作用关系有助于发掘潜在的抗病毒靶标。本研究首次利用iTRAQ技术对CDV感染前后的Mv.1.Lu细胞进行了比较蛋白质组学分析,并且对TLR3对CDV感染和复制增殖的影响和作用机制进行了研究,以期为有效防控水貂CDV感染提供一定的理论依据。为了揭示CDV与水貂细胞内蛋白之间的互作关系,我们利用蛋白质组学技术对CDV PS毒株感染前后24 h的Mv.1.Lu细胞内的蛋白表达变化情况进行了分析。共鉴定到520个差异蛋白,包括151个上调蛋白和369个下调蛋白。利用DAVID和UniProt数据库进行功能富集分析表明,差异蛋白参与多种生物学过程。Network和KEGG通路分析显示差异蛋白主要涉及NF-κB信号通路,此外还参与了NLRs和TLRs等通路...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 TLRS介导的天然免疫应答
1.1.1 TLRs的分布及其结构和相应配体
1.1.2 TLRs下游接头蛋白及其信号途径
1.1.3 非TLRs的其他PRRs
1.2 犬瘟热病毒（CDV）
1.2.1 CDV基本特性
1.2.2 临床特征
1.2.3 致病性研究
1.3 CDV与天然免疫应答
1.3.1 细胞因子与免疫抑制
1.3.2 细胞因子与脱髓鞘脑白质炎（DL）
1.3.3 IFNs与CDV感染
第二章 CDV感染Mv.1.Lu细胞的蛋白质组学分析
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞与病毒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要软件
2.1.5 溶液配制
2.1.6 病毒预处理
2.1.7 病毒感染Mv.1.Lu细胞的动力学实验
2.1.8 用于蛋白质组学分析的样品制备
2.1.9 iTRAQ定量
2.1.10 差异蛋白质数据的生物信息学分析
2.1.11 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）
2.1.12 WesternBlot实验
2.1.13 间接免疫荧光实验
2.2 实验结果
2.2.1 CDVPS毒株感染Mv.1.Lu细胞的动力学分析
2.2.2 差异蛋白的鉴定和定量
2.2.3 差异蛋白的亚细胞定位注释
2.2.4 差异蛋白的GO功能和KEGG通路注释
2.2.5 参与免疫应答过程的差异蛋白的互作网络分析
2.2.6 差异蛋白的验证
2.2.7 CDV感染激活NF-κB信号途径
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 TLRs对CDV感染诱导的NF-κB激活的影响研究
3.1 材料与方法
3.1.1 细胞与病毒
3.1.2 主要试剂及质粒
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要软件
3.1.5 引物的设计与合成
3.1.6 病毒感染及样品收集
3.1.7 RNA提取,cDNA合成和qRT-PCR实验
3.1.8 MTT实验
3.1.9 抑制效果检测
3.1.10 双荧光素酶检测实验
3.1.11 数据分析
3.2 结果
3.2.1 CDV感染诱导TLR3,TLR7,TLR8和NF-κBmRNA表达上调
3.2.2 ST2825和TLR3抑制剂的抑制效果分析
3.2.3 TLRs参与了CDV感染诱导的NF-κB的激活
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 TLR3对CDV复制增殖的影响研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验动物
4.1.2 细胞与病毒
4.1.3 主要试剂及抗体
4.1.4 主要仪器及软件
4.1.5 引物的设计与合成
4.1.6 水貂脾脏总RNA的提取及cDNA的合成
4.1.7 水貂TLR3基因中间片段的PCR扩增及序列验证
4.1.8 3 ＇RACE和5＇RACEPCR
4.1.9 水貂TLR3基因全长序列验证及生物信息学分析
4.1.10 水貂TLR3基因真核表达质粒的构建
4.1.11 水貂TLR3基因功能初步分析
4.1.12 病毒感染过表达TLR3的Mv.1.Lu细胞
4.1.13 TLR3抑制剂实验
4.1.14 Poly（I:C）刺激实验
4.1.15 MTT实验
4.1.16 双荧光素酶实验
4.1.17 间接免疫荧光实验
4.1.18 WesternBlot实验
4.1.19 数据分析
4.2 结果
4.2.1 TLR3基因中间片段PCR扩增及3'RACE和5'RACE扩增
4.2.2 TLR3ORF基因的序列验证
4.2.3 水貂TLR3基因编码蛋白的信号肽,跨膜区和结构域预测
4.2.4 水貂TLR3基因的序列分析
4.2.5 水貂TLR3基因的序列比对和进化树分析
4.2.6 pCMV-myc-TLR3表达质粒的构建
4.2.7 pCMV-myc-TLR3的表达分析
4.2.8 pCMV-myc-TLR3的功能初步分析
4.2.9 过表达TLR3限制CDV复制增殖
4.2.10 抑制TLR3表达促进CDV复制增殖
4.2.11 TLR3促进CDV感染中IFN-β和Mx1的表达
4.2.12 抑制NF-κB激活促进CDV感染和复制
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3052026
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 TLRS介导的天然免疫应答
1.1.1 TLRs的分布及其结构和相应配体
1.1.2 TLRs下游接头蛋白及其信号途径
1.1.3 非TLRs的其他PRRs
1.2 犬瘟热病毒（CDV）
1.2.1 CDV基本特性
1.2.2 临床特征
1.2.3 致病性研究
1.3 CDV与天然免疫应答
1.3.1 细胞因子与免疫抑制
1.3.2 细胞因子与脱髓鞘脑白质炎（DL）
1.3.3 IFNs与CDV感染
第二章 CDV感染Mv.1.Lu细胞的蛋白质组学分析
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞与病毒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要软件
2.1.5 溶液配制
2.1.6 病毒预处理
2.1.7 病毒感染Mv.1.Lu细胞的动力学实验
2.1.8 用于蛋白质组学分析的样品制备
2.1.9 iTRAQ定量
2.1.10 差异蛋白质数据的生物信息学分析
2.1.11 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）
2.1.12 WesternBlot实验
2.1.13 间接免疫荧光实验
2.2 实验结果
2.2.1 CDVPS毒株感染Mv.1.Lu细胞的动力学分析
2.2.2 差异蛋白的鉴定和定量
2.2.3 差异蛋白的亚细胞定位注释
2.2.4 差异蛋白的GO功能和KEGG通路注释
2.2.5 参与免疫应答过程的差异蛋白的互作网络分析
2.2.6 差异蛋白的验证
2.2.7 CDV感染激活NF-κB信号途径
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 TLRs对CDV感染诱导的NF-κB激活的影响研究
3.1 材料与方法
3.1.1 细胞与病毒
3.1.2 主要试剂及质粒
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要软件
3.1.5 引物的设计与合成
3.1.6 病毒感染及样品收集
3.1.7 RNA提取,cDNA合成和qRT-PCR实验
3.1.8 MTT实验
3.1.9 抑制效果检测
3.1.10 双荧光素酶检测实验
3.1.11 数据分析
3.2 结果
3.2.1 CDV感染诱导TLR3,TLR7,TLR8和NF-κBmRNA表达上调
3.2.2 ST2825和TLR3抑制剂的抑制效果分析
3.2.3 TLRs参与了CDV感染诱导的NF-κB的激活
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 TLR3对CDV复制增殖的影响研究
4.1 材料与方法
4.1.1 试验动物
4.1.2 细胞与病毒
4.1.3 主要试剂及抗体
4.1.4 主要仪器及软件
4.1.5 引物的设计与合成
4.1.6 水貂脾脏总RNA的提取及cDNA的合成
4.1.7 水貂TLR3基因中间片段的PCR扩增及序列验证
4.1.8 3 ＇RACE和5＇RACEPCR
4.1.9 水貂TLR3基因全长序列验证及生物信息学分析
4.1.10 水貂TLR3基因真核表达质粒的构建
4.1.11 水貂TLR3基因功能初步分析
4.1.12 病毒感染过表达TLR3的Mv.1.Lu细胞
4.1.13 TLR3抑制剂实验
4.1.14 Poly（I:C）刺激实验
4.1.15 MTT实验
4.1.16 双荧光素酶实验
4.1.17 间接免疫荧光实验
4.1.18 WesternBlot实验
4.1.19 数据分析
4.2 结果
4.2.1 TLR3基因中间片段PCR扩增及3'RACE和5'RACE扩增
4.2.2 TLR3ORF基因的序列验证
4.2.3 水貂TLR3基因编码蛋白的信号肽,跨膜区和结构域预测
4.2.4 水貂TLR3基因的序列分析
4.2.5 水貂TLR3基因的序列比对和进化树分析
4.2.6 pCMV-myc-TLR3表达质粒的构建
4.2.7 pCMV-myc-TLR3的表达分析
4.2.8 pCMV-myc-TLR3的功能初步分析
4.2.9 过表达TLR3限制CDV复制增殖
4.2.10 抑制TLR3表达促进CDV复制增殖
4.2.11 TLR3促进CDV感染中IFN-β和Mx1的表达
4.2.12 抑制NF-κB激活促进CDV感染和复制
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3052026
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3052026.html
