日本血吸虫RIO1和RIO2蛋白激酶基因克隆和表达

发布时间：2021-02-26 06:53

　　日本血吸虫是流行于东南亚的热带或亚热带地区及我国南方的人畜共患寄生虫。它能感染猪、牛、羊、狗、啮齿动物等多种哺乳动物和人,引起日本血吸虫病；因此我国对日本血吸虫病的防制投入了大量的人力和财力。50年的抗血吸虫病战役使我们获得了日本血吸虫病防制的三条经验：化学药物疗法、灭螺和防治宣传教育。不同的综合防制策略有效地抑制了日本血吸虫病在我国的发病率；但是这并不能根除日本血吸虫病在我国的流行。迄今为止,仍没有疫苗可用于防控日本血吸虫病；而抗吡喹酮血吸虫株的出现对我们仅依赖一种药物来防治该病提出了警示,说明急需开发新的药物和疫苗。蛋白激酶调控生物体内包括DNA复制、转录、翻译、细胞周期进程等一系列细胞过程,许多蛋白激酶也是极其重要的药物靶标。根据结构差异,蛋白激酶分为真核蛋白激酶（ePKs）和非典型蛋白激酶（aPKs）。非典型蛋白激酶包括13个家族,RIO激酶是非典型蛋白激酶家族的一员。RIO激酶是ATP依赖的丝氨酸蛋白激酶,由Rio1、Rio2和Rio3三个成员构成。Rio1和Rio2存在于从古菌到人的各种生物体内,而Rio3仅存在于多细胞真核生物体内。古菌Rio1和Rio2的晶体结构分析发现... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 文献综述
    1.1 日本血吸虫
        1.1.1 日本血吸虫概述
        1.1.2 日本血吸虫的生活史
        1.1.3 日本血吸虫的致病性及危害
        1.1.4 日本血吸虫病的诊断与防治
        1.1.5 日本血吸虫的基因组
    1.2 RIO蛋白激酶
        1.2.1 RIO蛋白激酶概述
        1.2.2 RIO激酶的一级结构特征
        1.2.3 RIO激酶的空间结构
        1.2.4 RIO激酶家族的功能
2 研究的目的与意义
3 材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 试验动物
        3.1.2 菌种与质粒
        3.1.3 主要试剂和酶
        3.1.4 溶液的配制
        3.1.5 主要仪器与设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 日本血吸虫成虫的收集
        3.2.2 引物的设计与合成
        3.2.3 日本血吸虫总RNA的提取
        3.2.4 3'-RACE第一链反应物的合成
        3.2.5 3'-RACE扩增Sj-Rio1和Sj-Rio2基因3’末端序列
        3.2.6 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小
        3.2.7 PCR产物的纯化回收
        3.2.8 目的DNA连接pMD19-T载体
2法制备大肠杆菌感受态细胞">        3.2.9 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
        3.2.10 连接产物转化DH5a感受态细胞
        3.2.11 菌液PCR鉴定
        3.2.12 PCR扩增日本血吸虫Rio1基因的ORF片段
        3.2.13 PCR扩增日本血吸虫Rio2基因的ORF片段
        3.2.14 质粒DNA的小量提取和鉴定
        3.2.15 Northern杂交
        3.2.16 质粒DNA的双酶切
        3.2.17 原核表达载体的构建
        3.2.18 原核表达载体的鉴定
        3.2.19 重组质粒原核表达条件的优化
        3.2.20 重组质粒大量表达靶蛋白
        3.2.21 日本血吸虫Rio1和Rio2截短蛋白的原核表达
        3.2.22 GST融合蛋白的纯化
        3.2.23 His融合蛋白的纯化
        3.2.24 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
        3.2.25 日本血吸虫Riol和Rio2蛋白多克隆抗体的制备
        3.2.26 ELISA测定多抗血清效价
        3.2.27 Western blot
        3.2.28 日本血吸虫组织蛋白提取
        3.2.29 Western blot检测制备多克隆抗体的免疫反应活性
4 结果与分析
    4.1 日本血吸虫Rio1和Rio2基因cDNA全长序列的获得
        4.1.1 日本血吸虫总RNA提取
        4.1.2 3'-RACE扩增日本血吸虫Rio1和Rio2的3’端DNA片段
        4.1.3 PCR扩增日本血吸虫Rio1和Rio2 ORF片段
    4.2 日本血吸虫Rio1和Rio2生物信息学分析
        4.2.1 日本血吸虫Rio1和Rio2基因结构分析
        4.2.2 日本血吸虫Rio1和Rio2分子进化分析
        4.2.3 日本血吸虫Rio1和Rio2保守结构域分析
        4.2.4 日本血吸虫Rio1和Rio2蛋白性质预测
    4.3 日本血吸虫Rio1和Rio2的mRNA Northern杂交
    4.4 日本血吸虫Rio1和Rio2 ORF全长的原核表达
        4.4.1 重组日本血吸虫Rio1蛋白的原核表达
        4.4.2 重组日本血吸虫Rio2蛋白的原核表达
    4.5 日本血吸虫Rio1和Rio2截短序列的原核表达
        4.5.1 日本血吸虫Rio1和Rio2截短序列的原核表达载体构建
        4.5.2 日本血吸虫Rio1和Rio2重组截短蛋白的诱导表达
        4.5.3 重组日本血吸虫Rio1和Rio2截短蛋白的纯化
    4.6 多克隆抗体的制备
        4.6.1 抗日本血吸虫Rio1和Rio2多克隆抗血清的效价测定
        4.6.2 抗日本血吸虫Rio1和Rio2多克隆抗体的免疫反应性
    4.7 Western blot确定日本血吸虫组织中Rio1或Rio2蛋白
        4.7.1 重组GST-Rio1或GST-Rio2蛋白的Western blot
        4.7.2 日本血吸虫总蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        4.7.3 日本血吸虫体内Rio1和Rio2蛋白的Western blot
5 讨论
    5.1 日本血吸虫Rio1和Rio2基因生物信息学分析
    5.2 日本血吸虫Rio1和Rio2的Northern杂交
    5.3 日本血吸虫Rio1和Rio2的蛋白表达
    5.4 日本血吸虫Rio1和Rio2的多克隆抗体及应用
6 结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3052224