猪流行性腹泻病毒FQ-PCR检测方法的建立及四个毒株全基因测序和进化分析

发布时间：2021-03-02 14:01

　　猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea, PED）的病原,属于冠状病毒科,为有囊膜,单股正链RNA病毒。该病是一种急性、高度接触性的传染病,以严重肠炎、呕吐和水样腹泻为特征,对我国养猪产业造成严重的经济损失。2010-2012年,PED在免疫猪场的再次爆发说明我国流行毒株可能发生了变异,导致疫苗免疫效果下降,因此对我国流行毒株进行系统进化分析,比较疫苗株与野毒株之间的差异,有利于更具保护力的新型疫苗的开发。首先,建立了PEDV的实时荧光定量PCR检测方法并应用于PEDV细胞培养物中病毒拷贝数的检测。根据PEDV M基因保守序列设计合成一对引物和探针,通过反应条件和反应体系的优化,成功建立了TaqMan实时荧光定量PCR （FQ-PCR）检测方法,该方法具有特异、灵敏、快速等优点,在101-109拷贝/u1之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%-110%之间。其次,本研究根据GenBank上登录的PEDV参考株CV777（AF353511... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
上篇 猪流行性腹泻研究进展
    1 猪流行性腹泻的历史背景
    2 病原学
        2.1 病毒的形态
        2.2 分类地位
        2.3 理化特性
        2.4 细胞培养特性
        2.5 病毒基因组及其编码蛋白
    3 流行病学
    4 诊断方法
        4.1 RT-PCR诊断方法
        4.2 免疫电镜
        4.3 免疫荧光
        4.4 酶联免疫吸附试验
        4.5 实时荧光定量PCR
    5 PED的治疗
    6 PED的预防
        6.1 PEDV灭活苗
        6.2 PEDV弱毒苗
    参考文献
下篇 试验研究
    第一章 PEDV荧光定量检测方法的建立及JS2008毒株在VERO细胞中的定量检测
        摘要
        Abstract
        1 材料与方法
            1.1 菌株、毒株及病料
            1.2 主要试剂和仪器
            1.3 引物和探针的设计及合成
            1.4 重组质粒标准品的制备
            1.5 FQ-PCR检测方法的建立
        2 结果与分析
            2.1 质粒标准品的制备
            2.2 FQ-PCR反应条件的优化
            2.3 FQ-PCR标准曲线的建立
            2.4 FQ-PCR的敏感性分析
            2.5 FQ-PCR的重复性分析
            2.6 FQ-PCR的特异性分析
            2.7 细胞培养物中PEDV的定量检测
        3 讨论
        参考文献
    第二章 PEDV全基因组测序及序列分析
        摘要
        Abstact
        1 材料与方法
            1.1 细胞和毒株
            1.2 样品
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器设备
            1.5 引物
            1.6 RNA的提取
            1.7 反转录
            1.8 PCR
            1.9 PCR产物鉴定及纯化回收
            1.10 PCR产物连接与转化
            1.11 重组质粒提取、鉴定及序列测定
            1.12 全基因组序列确定、分析和比较
            1.13 参考序列
        2 结果
            2.1 JS2008、AH2012、JS-HZ2012和SX2012毒株的基因组结构及分析
            2.2 S基因序列分析
            2.3 ORF3进化分析
            2.4 E基因序列分析
            2.5 M基因序列分析
            2.6 N基因进化分析
        3 讨论
        参考文献
全文结论
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J]. 刘邓,袁秀芳,冉多良,徐丽华,牛登元,王朝文,王一成.  中国动物传染病学报. 2010(01)
[2]猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究[J]. 邹勇,钱永清,唐永兰,苏万国,何锡忠.  上海农业学报. 2003(02)
[3]猪流行性腹泻病毒分子生物学特征[J]. 张强敏,郭福生,尹燕博,沈秋姑.  中国病毒学. 2002(04)
[4]猪流行性腹泻弱毒株的培育[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,王明,马思奇.  中国畜禽传染病. 1998(06)
[5]应用直接免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 林志雄,黄引贤,李树根,李力复,童昆周.  中国进出境动植检. 1997(02)
[6]猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验[J]. 马思奇,王明,周金法,冯力.  中国畜禽传染病. 1994(02)
[7]猪流行性腹泻灭活疫苗的研究[J]. 王明,马思奇,周金法,于文涛,魏风祥,崔现兰,冯力,佟有恩,黄绍棠,刘长明.  中国畜禽传染病. 1993(05)
[8]使用细胞培养单层分离猪流行性腹泻病毒[J]. 李树根,李力施,霍燕琼,李力复,童昆周.  中国兽医科技. 1991(10)
[9]猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒的免疫电镜诊断的研究[J]. 王继科,刘长明,马思奇,王明,魏凤祥,于文涛,周金法.  中国畜禽传染病. 1991(02)
[10]应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究[J]. 崔现兰,马思奇,王明,于文涛,魏风祥,周金法.  中国畜禽传染病. 1990(05)



本文编号：3059387