西藏藏猪耐低氧基因ECE1的分子克隆及其表达分析

发布时间：2017-04-14 14:00

  本文关键词：西藏藏猪耐低氧基因ECE1的分子克隆及其表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高原地区的低气压和低氧分压严重影响着人类和动物的生存与发展。高原无论在政治经济以及军事等很多方面都具有很重耍的意义,而且研究高原低氧反应和低氧适应的机理一直以来是受到生物学及医学关注的重要领域。低氧适应是一个复杂的性状,它受多种因素的影响。内皮素转化酶1(Endothelin converting enzyme 1,ECE1)是近期发现的与耐低氧有关的重要候选基因,属于内皮素转化酶家族中的一员,是内皮素-1(ET-1)生物合成过程中的关键限速酶,但是其cDNA序列还没有获得。为了进一步了解和认识ECE1基因的结构和功能,揭示ECE1对藏猪耐低氧能力的影响,寻找与低氧相关联的分子标记。本研究采用RACE技术,获得了藏猪ECE1基因的完整cDNA序列,并进行了克隆测序,采用生物信息学技术,分析并预测了基因的结构和功能。用qPCR和Western Blot技术,对比检测了ECE1基因在藏猪、莱芜猪、大白猪不同品种猪的组织差异表达。主要研究结果如下:1.ECE1基因cDNA序列全长3771 bp(Gen Bank登录号:KP411748),包含2 bp的5′UTR和1507bp的3′UTR序列。全部CDS序列2262 bp,编码753个氨基酸,分子量为85.449kDa,等电点p I为5.49。ECE1基因编码的氨基酸序列中,存在10个N-糖基化位点和45个磷酸化位点。二级结构中大部分为α螺旋,属于跨膜蛋白。在进化过程中高度保守,与牛、人和家鼠的氨基酸序列同源性分别为97%、96%和96%。基于蛋白序列所构建的分子进化树,表明猪ECE1蛋白与骆驼的亲缘关系最近。2.运用DNAMAN软件对藏猪、莱芜猪和大白猪的ECE1基因序列进行了对比分析,获得9个基因突变位点,其中一个为非同义突变,在1055位点,导致了氨基酸序列351位置的缬氨酸变成了异亮氨酸。通过三级结构预测,藏猪与平原猪相比,其蛋白质结构也发生了变化。3.在mRNA水平上,ECE1是一个广谱表达基因,在肌肉、肝脏、背膘脂肪、肺脏、肾脏、心脏、脾脏、胰脏、胃和大脑中都能检测到,且在心和胰脏之间存在明显的组织表达差异(P0.05),其在心和肺中表达量较高,在胃和胰脏中表达量较低。在心、肺和肝脏三种组织中ECE1基因mRNA的表达量存在明显的品种差异(P0.05);并且ECE1基因mRNA的表达量在三个猪种中始终是肝脏肺脏心脏肌肉背膘脂肪。在蛋白水平上,三个猪种的ECE1表达水平与定量检测结果具有一致性。ECE1在心脏和肺脏组织中的高表达,说明心肺功能是影响藏猪耐低氧性状的重要因素。
【关键词】：西藏藏猪 ECE1 耐低氧性状 基因克隆 表达对比分析
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 英文缩略词表4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-16
• 1.1 西藏藏猪与低氧适应11-13
• 1.1.1 西藏藏猪11-12
• 1.1.2 低氧适应12-13
• 1.2 内皮素转化酶 1（ECE1）13-14
• 1.2.1 内皮素13-14
• 1.2.2 ECE1基因的研究进展14
• 1.3 cDNA末端快速扩增技术14-15
• 1.4 本研究的目的和意义15-16
• 2 材料与方法16-38
• 2.1 试验材料16-21
• 2.1.1 试验动物与样品采集16
• 2.1.2 主要仪器设备16-17
• 2.1.3 网络资源及软件17-18
• 2.1.4 主要试剂及耗材18-19
• 2.1.5 主要试剂的配制19-21
• 2.2 试验方法21-38
• 2.2.1 ECE1基因的cDNA全长扩增21-25
• 2.2.2 cDNA全长的测序25-28
• 2.2.3 生物信息学分析28-30
• 2.2.4 三个猪种间的序列差异分析30-31
• 2.2.5 荧光定量PCR的检测分析31-33
• 2.2.6 Western Blot的检测分析33-37
• 2.2.7 数据分析37-38
• 3 结果与分析38-55
• 3.1 藏猪ECE1基因的cDNA全长的克隆38-39
• 3.1.1 总RNA的提取与质量检测38
• 3.1.2 5′RACE、3′RACE和中间片段的PCR扩增38-39
• 3.1.3 菌液PCR阳性鉴定结果39
• 3.2 测序结果分析39-41
• 3.3 生物信息学分析41-48
• 3.3.1 ORF区的预测41-42
• 3.3.2 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析42
• 3.3.3 蛋白质疏水性与二级结构42-43
• 3.3.4 跨膜区和亚细胞定位的预测43-44
• 3.3.5 信号肽和二硫键预测44-45
• 3.3.6 糖基化和磷酸化位点预测45
• 3.3.7 蛋白质三级结构预测45-46
• 3.3.8 序列间的多重比对和蛋白质氨基酸分子进化树46-48
• 3.4 三个猪种间的序列差异分析48-50
• 3.5 藏猪ECE1基因的表达检测分析50-55
• 3.5.1 内参基因的筛选50-51
• 3.5.2 qPCR标准曲线和溶解曲线的制备51
• 3.5.3 藏猪ECE1基因的组织表达谱分析51-52
• 3.5.4 藏猪、莱芜猪和大白猪不同组织中ECE1基因的表达差异分析52-55
• 4 讨论55-59
• 4.1 ECE1的生物信息学分析55-56
• 4.2 三个猪种间的序列差异分析56-57
• 4.3 ECE1基因mRNA与蛋白质的组织和品种差异表达57-59
• 5 结论59-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间发表论文情况71

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